Основные характеристики приборов-спектрофотометров.
Спектральный диапазон.
НК – 260 нм, УФ длинноволновый диапазон.
Короткий УФ, жесткий – 200 нм.
Tris поглощает на 230, так что если хотим померитьна 200-230, нужно удалить низкомолекулярные вещества. Но удалить все не получится. Так что особого смысла в использовании широких диапазонов нет.
У белков максимум поглощения – в более длинноволновой области.
Но все равно лучше иметь прибор, диапазон которого начинается с 190. Зачем? Если расширим диапазон, можем оценить наличие примесей, их соотношение и количество.
Оптимум – от 190 до 1100, вплоть до области видимого света.
Препарта ДНК спермы лосося – его легко очищать, и можно получить сухой препарат. Продается на вес чуть ли не килограммами. Высоко полимерная НК. Длинные тяжи белого цвета.
Обычно биоплимеры бесцветные. Но есть исключения, и даже окрашенные микроорганизмы.
Зачем нужен видимый свет? Например, чтобы измерить плотность суспензии клеток. Только это не истинные растворы, а коллоидные.
Спектральная ширина полосы пропускания – «щель». Этот показатель говорит о том, с какой точностью можно задавать длину волны. Лучше узкая, нм.
Точность установки длины волны
Воспроизводимость установки длины волны
Фотометрический диапазон – диапазон D, при которых обеспечивается разумная точность.
Рассеянный свет
Фотометрическая точность
Фотометрическая воспроизводимость
Дрейф нулевой линии
Уровень шумов – тоже задает диапазон, только с другой стороны – область малых концентраций, т.е., насколько прозрачным может быть раствор. Для расчета минимально необходимого для измерения вещества.
Скорость сканирования
Размеры
Часто спектр снимается пошагово. С каких длин волн лучше начинать измерения, с малых или больших? С больших, чтобы ДНК УФ в куски не порезать. Чем длиннее волна, тем больший химический вред принесет.
Можно сразу облучать полихроматическим светом, а потом деление по длинам волн относится к детектору. Тогда получим весьспектр за одно измерение.
Источник света – первостепенная инженерная задача, до сих пор не решенная. Должна быть пологая кривая спектральной эффективности, т.е, источник должен излучать свет всех длин с одинаковой интенсивностью, но ТАКИХ НЕТ!
т.к все источники света, например, ртутные лампы высокого давления, используют резонансные эффекты. Если это разряд в парах ртути, то там будет максимум, который соответствует резонансу этого вещества. Более того, чем ближе в резонансу, тем эффективней источник.
В общем, чем монохроматичней источник, тем больше резнансные эффекты, тем более крутая крвая интенсивностей.
Ни один источник света не покроет диапазон 190 – 1100 нм => нужно несколько источников. Ртутные или дейтериевые лампы высокого давления для УФ области, перекальные лампы накаливания для области видимого света. И источники просто переключаются в нужный момент.
Почему повсеместно не используются такие приборы? Все остальные параметры – очень плохо. Твердотельные источники (светодиоды) – очень неравномерная спектральная характеристика. Точность измерения будет резко зависеть от длин волн.
Точность зависит от длин волн – катастрофа.