Проблема выбора генов в генетической инженерии

Пытались совмещать в различных комбинациях гены пластид и хромосом. Но введение информации по фотосинтезу резко дестабилизовало весь процесс. Не получены улучшенные растения.

 

В отношении азотфиксации, полезна мысль о возможности исопльзования генов фзотфиксаторов, заставило более подрбно изучать азотфиксацию. Оказалось, что у всех азотфиксаторов системы азотфиксации сложны но и продукты генов, имеющих отношение к фиксации азота должны функционировать в строго определенных условиях, создаваемых клеткой. Даже в самых простых случаях (клебсиелла) 17 генов для собстввенно фиксации и около 20 для создания условий гены подвержены жесткой и не полностью изученной регуляции. И упорядоченность выражения генов определяет возможность фиксации азотой. Перетащить такой блок генов может и можно, но создать условия практически невозможно. Подход по расширению круга хозяев азотфиксаторов тоже оказались не плодотворными. Только бобовые вступают в контакт с ризобиями. Тогда начали активно изучать процесс симбиоза, стало известно о sim плазмидах. Найти особенности в генетическом аппарате бобовых, обеспечивающих контакт не удалось до сих пор.

 

Успешно решили задачу по устойчивости к гербицидам. Накопление гербицидов в таких концентрациях, что они ограничивали рост сельскохозяйственных растений. Часть земель даже вывели из использования. Гербициды условно можно разделить на 3 группы по характеру воздействия:

1. Гербициды, ингибирующие фотосинтез (симметричные триазины: атрозин, симазин; производные мочевины)

1. Глифасад и амитрол, подавляют синтез ароматических аминокислот у растений.

1. Ингибирование синтеза разветвленных аминокислот (сульфометурон-метил)

 

Эти гербициды вводились постепенно и большая часть - подобрана эмпирически в середине 20 века. А потом изучали характер действия на растение. Те, кто хотел получить устойчивые растения использовали несколько подходов. Один заключался в том, чтобы получить мутантные варианты растений, которые бы утратили чувствительность к гербициду и попытаться использовать гены, которые у таких растений изменились. Второе направление - создать генноинженерными путями толерантность к гербициду и достичь ее можно тремя путями:

• Увеличить количество того продукта, который является мишенью для гербицида. Один из вариантов - амплификация гена, если он известен, или постановка под более сильный промотор.

• Попытаться заменить ген в каком-то растении, продукт которого является мишенью для гербицида на другой ген, близкий по функции, но нечувствительный к гербициду.

• Введение в геном растения каких либо генов, кодирующих продукт, способных осуществлять детоксикацию гербицидов.

 

Для реализации этих подходов нужна информация о генах, связанных с действием гербицида и устойчивостью к нему. В отношении гербицидов 1 класса, он действует так: атрозин присоединяется к мембранам тилакоидов и блокирует транспорт электронов к белку Qбета. Этот белок кодируется хлоропластным геном. Ген был изолирован - psb A. И оказалось, что у мутантных сорняков, устойчивых к атрозину этот белок отличается всего одной аминокислотной заменой серина на глицин в 228 положении. Но этого достаточно, чтобы Qбета переставал быть мишень. Позже обнаружили еще мутанты, где были заменены другие аминокислоты. Такие замены приводили к снижению основной активности белка. Эти сорняки росли хуже. Ген был отклонирован, поставлен под промотор нопалинсинтетазы и объединен с последовательностью транзитного пептида из гена rbcS (малая субъединица рибулозо-бисфосфат-карбоксилазы). Сделали на табаке и первым, кто получил устойчивые растения - Фалько и соавторы.

 

 

 

Лекция 11

Устойчивость к гербицидам.

Источником мутантных генов к этим гербицидам могут быть цианобактерии и одноклеточные эукариоты - Chlamidomonas reincardi. Устойчивые варианты - путем отбора на средах с гербицидами. Такие гены с эукариотическими промоторами вводились в растения.

 

Устойчивость к гербицидам второй группы (глифосат), создана путем введения соответствующих генов. Это производные глицина. Широко применялся, действует как ингибитор синтеза аромат аминокислот. Мишень - 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетаза (EPSP). Ген в ядре. Обнаружить сорные устойчивые растения - не удалось. Чувствительны не только растения, но и бактерии, что и было использовано. Удалось получить бактерии с высоким уровнем устойчивости. Бактериальные мутанты были двух типов. Одна группа - сверхпродукция фермента. Использовать их как источник резистентности - невозможно. Во второй группе - мутанты по самому ферменту (ara A мутанты), имели фермент, который не связывал гербицид.

ДНК мутантных генов объединяли с ДНК, кодирующей транзитный пептит рубиско гороха. Этот химерный ген вводили в промежуточный вектор в клетках коли. И затем передавали эту конструкцию в агробактерию с плазмидой pGV3850 (плазмида для работы с коинтегратами - вырезана часть Т-ДНК, вставлен кусок pBR - для рекомбинации). Сначала делали на табаке, а затем получили и трансгены. Устойчивость получили в качестве пробного эксперимента во многих лабораториях.

Устойчивость к глифосату может возникать и при цитоплазматической локализации мутантного гена.

 

Для получения трансгенов, устойчивых к гербицидам третей группы (хлорсульфурон, сульфометуронметил) - тот же подход. Эти гербициды широко используются. Они действуют на изофермент 2 ацетолактатсинтетазы - Als II. Это фермент нужный для биосинтеза изолейцина и валина - первый фермент биосинтеза разветвленных аминокислот. У растений гены кодирующие этот фермент имеют ядерную локализацию. Но продукт имеет транзитный пептид и транспортируется в хлоропласты. У микробов есть путь биосинтеза этих аминокислот, то мутантов получали и из бактерий и из дрожжей (пекарских). Ген был клонирован из S. typhimurium и с эукариот промотором введен в растительные клетки, устойчивость проявлялась. С дрожжами оказалось неудачными. Удалось получить устойчивые растительные клетки в культуре - табака и арабидопсиса. Из растений стали брать гены устойчивости и переносить их в сельскохозяйственные растения.

 

Все эти примеры - реализация линии, направленной на изменение мишени для гербицида. Велись работы по внедрению способности разрушать гербицид. В начале 90 были получены такие растения, устойчивые к биалофосу - природный гербицид, который получают из актиномицетов: Streptomyces viridochromogenes и еще один - продуценты. Сам гербицид - трипептид из двух L-аланина и одного остатка фосфинатрицина (аналог глутамата, является действующим компонентом). Фосфинотрицин высвобождается под действием протеаз и необратимо инактивирует фермент в ассимиляции аммония - глутаминсинтетазу, из-за этого растение погибает. Источник резистентности - сами продуценты. Предположили наличие механизм защиты у S. hygroscorpicus обранужили ген, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансферазу (PAT). Под воздействием этого фермента фосфинотрицин превращается в нетоксичный продукт, который не связывается с глутаминсинтетазой. Этот ген поставили под промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, с другой стороны от гена bar добавили сигналы полиаденилирования и терминации транскрипции одного из генов октопиновой агробактериальной плазмиды. Потом химерный ген объединили с маркерным геном неомицинфосфотрансферазы и поставили под промотор нопалинсинтетазы, все это ввели в pGV1500. вводили в растения, сначала на табаке, затем получили картофель, томаты, рапс, сахарный тростник. Использование таких растений предохраняет почвы от загрязнения гербицидом. Причем происходит очищение ранее загрязненных виалофосом почв.