Аденоассоциированные

Изначально они неспособны репродуцироваться в клетках, не патогенны, геном - одноцеп ДНК размером 4,7 т н. Когда эта ДНК проникает в клетку, достраивается до двунитевой и интегрируется в 19 хромосому. Когда в этой же клетке - аденовирус, возможна транскрипция, трансляция и формирование вирионов аденоассоциированного вируса. Геном этих вирусов похож на транспозон: по концам их ДНК - инвертированные повторы длиной 125 нуклеотидов. В них - сайты инициации репликации и транскрипции. Если поместить между ними какую-то ДНК, эта конструкция будет воспроизводится клеткой. Максимальная емкость 4,5 тн. Но чтобы ее достичь надо использовать плазмиду помощник. На этой плазмиде - rec, cap гены, продукты которых нужны для дальнейших правильных событий. Их ставят под промоторы, активные в клетках млекопит, чтобы они одновременно экспрессировались. Для получения вирусных частиц, нагруженных генетической информацией, зараженные аденовирусом клетки трансфецируют двумя этими плазмидами, в результате образуются вирионы обоих вирусов. Разделяют центрифугированием и диализом. Чтобы обезопасится от аденовирусов, разработана методика прогревания.

 

 

Лекция 17

Вирус простого герпеса1.

Изучен был достаточно хорошо. Геном из двунитевой ДНК. Длина 152 тысячи пар. Выражена неронотропность. Жизненный цикл таков, что после проникноввения в клетку репродукция начинается после определенных условий - вирус считается латентным. Вектора на основе - перспективны для генотерапии длительнотекущих нервных заболеваний. В геноме выявлены области, замена которых на чуж ДНК не сказывается на основных этапах репродукции. Но работать с вирусной ДНК сложно из-за больших размеров. Созданы и используются специальная система из 2 компонентов. Первая - колийная плазмида, в которую клонированы 2 участка генома вируса:

• Последовательность, необходимая для упаковки

• Точка начала репликации вирусной ДНК

 

Все остальные участки - стандартны (pBR коли). Полилинкер - между участками генома вируса. Второй компонент системы - вирус простого герпеса, в котором нет последовательностей, которые есть в плазмиде. Не может паковаться и репродуцироваться, но кодирует все необходимое для репродукции вирусной ДНК. Для получения вирионов, в которых содержалась бы чужДНК клетки сначала инфицируют вирусом помощником, а затем вводят в них плазмидную ДНК с нужным геном. Репликация вирусной ДНК и ДНК плазмиды происходит по модели катящегося кольца - однонит разрыв в ori к 3' концу - новые нуклеотиды, а вторая - ковал замкнута, служит матрицей. По достижении размера, который соответствует размеру вир генома - отрезание фрагмента, а репликация идет дальше. Параллельно в клетке нарабатываются капсиды, и упаковка нарезанных фрагментов. Идет амплификация. Вся плазмида, в которую вставлен ген - в 10 раз меньше исходного вир генома. Пакуется 10 копий введенного гена. Плазмида носит название ампликона.

 

Если нет возможности использовать такую систему (нет в распоряжении вируса помощника), чтобы создавать вирусы, нужны пакующие линии клеток. Но возможно получение вектора с конкретным геном по схеме рекомбинации. В этом случае используется плазмида, в которой вводимый ген находится в незначащей области вируса генома (в плазмиде между участками, которые в геноме незначащие). Около 30 тысяч пар. При совместном введении плазмиды и обычного вируса в клетки происходит гомологичная рекомбинации, происходит замена части последовательности вируса. Это неконтролируемая рекомбинация. Не очень велик выход. Более важно, что надо отбирать. (гибридизация, ПЦР), только одна копия гена. Трудно очистить культуру с нужным геном от остатков нормального вируса. Поэтому больше работают с ампликонами.

 

Все векторные системы на оснвое вирусов потенциально могут быть использованы для генотерапии. Но есть проблемы из-за того, что возможно инфицирование. Поэтому пробовали разные пути введения информации в организм, возможна бомбардировка микрочастицами золота.

Используют и липосомы. Подобранные липидные молекулы с положительным зарядом смешивают с ДНК. Возникают везикулярные структуры - липоплексы. Проходят в клетку хорошо, для клетки такая структура эквивалентна фагосоме, сливается с лизосомами и значительная часть ДНК разрушается лизосомными ферментами.

 

Использование ДНК конъюгатов - смишивают с полилизином, который связан с белками, специфичными к определенному клеточному рецептору. Полилизин образует везикулярные структуры, внутри которых оказывается ДНК, но поверхность несет белки, комплементарные рецепторам. Стараются присоединить как можно больше белка. В этом случае эффективность поглощения значительно выше, во вторых можно ожидать что будет присоединяться к нужному типу клеток. Оказалось, что образующиеся эндосомы не склонны сливаться с лизосомой.

 

Введение суспензии молекул ДНК в чистом виде в мышечную ткань. ДНК может попадать в клетки.

 

При всех этих методах размер молекул может быть любым. Введение искусственных хромосом будет вестись именно так. Искусственные хромосомы разрабатываются - объединение теломер-центромер и Ori. При этом возможно несколько путей для получения микрохромосом.

• Укорочение исходной хромосомы и анализировали ее поведение после введения

• Укороченные хрмосомы улучшали за счет замены центромерной области на ту, которая лучше в укороченном варианте (вводили в вирусном векторе, далее рекомбинация).

 

Пробуют использовать YAC для млекопитающих. В них вводятся некоторые фрагменты хромосом млекопитающих. Введение - микроинъекция, либо электропорацией, либо кальциевой трансфекцией в клетки мышей (эмбриональные стволовые).