Ретровирусные векторы

5' LTR

Пси область - ответсвенна за упаковку

Gag - 3 белка внутренней оболочки капсида

Pol - кодирует обратную транскриптазу и интегразу

Env - кодирует белок оболочки

3'LTR

 

Жизненный цикл - синтез кДНК, транспортируется в ядро, где встраивается в хромосомы в конкретные сайты за счет концевых повторов. После встраивания - транскрипция с промотора в 5'LTR - сильный промотор, много РНК, дает белки. При их появлении - часть молекул упаковывается в капсид.

 

Наличие ДНК стадии делает возможным осуществелние всех манипуляций на уровне ДНК. Для создания векторов использовали кДНК. Их объединяли с pBR322 и дальше получали обезоруженные варианты - лишенные env, pol, и части gag. Вставка встык с gag, что позволяет транскрибировать с промотора 5'LTR. Но могут быть и свои промоторы. Такую ДНК можно вводить кальциевым методом или электропорацией, но эффективность не высока - нарушается перемещение в ядро и интеграция. Вирус интегрирует лучше.

 

Разработали систему упаковки гибридных молекул. 2 варианта вируса: 5'LTR, gag, 3'LTR. И второй - содержит pol, env. Лишены области пси. Синтез всего необходимого для капсида. Если в эти клетки ввести вектор, в котором есть эта область, то происходит упаковка этой ДНК с нужным геном. Получают вирусные частицы.

 

Система эффективнка, но емкость первых векторов не более 8 тпн - не больше дикой молекулы РНК. Есть варианты векторов, которые способны заражать неделящиеся клетки. Есть варианты клеточных линий, дающие частицы с измененной специфичностью. Исходно поражают не все клетки. Формирование ложно фенотипа. Используют пакующую линию, в хромосомах которой - один укороченный вирус (gag, pol) в такую линию - 2 вектора. Один из них - экспрессирует белок с определнной специфичностью. Котрансфекция с вектором, который нужно упаковать. Есть варианты, где можно сделать env очень высокоспецифичным. Четвертый варинт - вариант с регулируемой экспрессией вводимого гена. Берут конструкцию, в которой промотор активен либо в определенных клетках, либо при условиях среды.

 

Аденовирусные векторы

Сконструировали с помощью ретровирусных векторов линию, в которой фрагмент ДНК аденовируса с геном Е1. он необходим для инициации образования вирусных частиц и освобождения из клетки (лизис). Затем - плазмида, содержащая фрагмент ДНК, в который встраивают ген, выбранный для введения в клетки млекопитающих.

Правый - несколько единиц ген карты вируса начиная с нуля, и второй - левый несколько единиц карты до 17-й. Одновременно получен укороченный вариант аденовируса, у которого удален область, соответствующая 0-9 единицам карты. В этом месте - Е1 ген вируса. Это Е1- вирусы. В результате котрансфекции клеток этой линии такой плазмидой за счет рекомбинации образуется полноразмерная ДНК, в которой есть Е1. в клетках репродукция вируса, но упаковывается ДНК, которая несет вставку. Упаковка и выход обеспечивается Е1 из хромосомы. Получаются частицы, которые будут использованы как содержащие вектор. При этом в клетках не образуются частицы, клетки не лизируются, поскольку Е1 в них нет. Недостаток этого ветора - ограниченная емкость до 7,5 тпн и отсутствие стабильной интеграции.

 

Для повышения емкости использовали следующий подход. Создали плазмиду коли, в которую ввели 5'концевую и 3'концевую области аденовирусной ДНК. Области эти размером по 4 тыс каждая и включают в себя точку инициации репликации, последовательность, отвечающую за упаковку, и терминирующую область. В такую плазмиду можно вставлять между этими фрагментами до 36 тпн. Плазмида должна разрезаться в единственном сайте, так чтобы фрагменты аденовирусной ДНК образовывали концы. Затем такую разрезанную ДНК совместно с ДНК вируса помощника вводят в клетки той линии, которая несет ген E1. вирус помощник - укороченный варинт вируса без Е1. он дает все необходимое для репликации и упаковки, но сам не пакуется. Упаковывается плазмидная ДНК.