I конструирование библиотеки днк

• ультразвуковая фрагментация анализируемой ДНК

• пришивка адапторов и денатурация ДНК

• получение эмульсии, содержащей в микрокапле единичные фрагменты ДНК и полистерольные шарики с пришитым праймером

• проведение эмульсионной ПЦР

• отмывка микрошариков от реагентов

• загрузка шариков в лунки проточной камеры

• загрузка лунок микрошариками с иммобилизованными ферментами

II загрузка пиротитровальной планшетки

III секвенирующая реакция

Перспективы пиросеквенирования : увеличение длины прочтения до уровня метода Сэнгера, автоматизация эмульсионной ПЦР

№ 9 Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов второго поколения,

использующих детекцию протонов (Ion Тоrrепt)

Принцип: детекция флуоресценции присоединенных ДНК – полимеразой нуклеотидов

Длина читаемой последовательности - 100 н.п

Кол-во одновременных реакций – 2 млрд

Продолжительность рабочего цикла -8 дней

Кол-во оснований в сутки – 25 млрд н.п

Реакция проходит в центре прибора ( в проточной камере с 8 каналами)

1. фрагменты ДНК иммобилизуются на поверхности проточной камеры, затем амплифицируются при помощи ПЦР, в результате чего получают до миллиардов кластеров с идентичными молекулами ДНК в каждом

2. регистрация включения нуклеотида

это пошаговая процедура , каждый шаг включает в себя

а) присоединение нуклеотида с флуоресцентным терминатором

б) считывание флуоресценции

в) отсоединение терминатора вместе с флуоресцентной меткой

3) считывание последовательности ДНК ( после присоединения каждого нуклеотида прибор сохраняет изображение флуоресценции всех кластеров проточной камеры, анализ изображений позволяет определить последовательность присоединенных нуклеотидов при копировании каждой матрицы)

10. Геномные секвенаторы третьего поколения: принцип действия и преимущество

Несмотря на то, что речь идет о сиквенсе ДНК, здесь работает совершенно другой фермент – ДНК –лигаза.

Существуют небольшие, но отличия от секвенирования методом пиросеквенирования:

• здесь короче длина читаемой последовательности 75 н.п ( 400 н.п)

• фрагменты читаются с 2 сторон

• кол-во основания в сутки 12млрд ( 1.25 млрд)

суть : готовится библиотека как и при пиросеквенировании

Здесь идет эмульсионная ПЦР и фиксация продуктов на полистерольных шариках. Фрагментируется геномная ДНК, на концы пришиваются адаптеры, добавляются к шарику, идет эмульсионная ПЦР

Стандартно на шарике зафиксированы праймеры и после пцр мы получаем шарик с большим кол-вом матриц для секвенирования , далее шарики фиксируют на плоской подложке, где они распластываются по стеклу , а ДНК лежит кучкой вокруг них

1)На I стадии используются 2 праймера : один длинный – олигонуклеотид, диной до 20 н.п, который будет хорошо отжигаться с адаптерной последовательностью, а затем на 1 и последующих шагах добавляется относительно короткий нуклеотид,который имеет 8 букв ( важными являются2 первые) Далее добавляется лигаза , после чего образуется ковалентная связь,

2) затем считывается флуоресценция ( чтобы произошло лигирование, все 8 нуклеотидов должны спариться с матричной последовательностью)

3) Далее происходит удаление флуорофора

4) После чего стадии повторяются еще 7-8 раз

5) Далее происходит удаление продукта и отжиг нового праймера со сдвигом на 1 нуклеотид

6) Повторение шагов 1-4

7) повтор реакции еще с 3 праймерами

ПРЕИМУЩЕСТВА РЕАКЦИИ –эта система позволяет показать , ошибочно включение или нет

№11 Основные задачи аннотации геномных последовательностей

1. идентификация кодирующих последовательностей

2. идентификация регуляторных последовательностей

3. функции генов

а) компьютерные методы Наиболее экономически целесообразно использовать компьютерные подходы везде, где это возможно.

Поиск кодирующей последовательности.

Эта проблема имеет разную актуальность у прокариот и эукариот для прокариот – это не проблема, для эукариот – колоссальная проблема. Необходимо найти стартовый кодон , однако если подвинуть на один нуклеотид, потом ещё на один, можно найти ещё рамки считывания , то есть каждая последовательность ДНК несёт шесть рамок считывания, из которых только одна реально является кодирующей, у прокариот выяснить это просто – графически рисуем все рамки, которые есть. Верхние три рамки в одну сторону, нижние три в другую , сама длинная рамка считывания – и есть нужная.

Есть другие факторы, которые также могут использоваться для поиска кодирующей последовательности -характерные промоторные элементы , ТАТА-бокс , однако она встречается и спонтанно с достаточно высокой частотой , для млекопитающих SPG-острова , они присутствуют не везде, но практически везде где есть такой островок – практически всегда это промоторная область гена. Большую помощь оказывает использование гомологии с уже известными кодирующими последовательностями , кодирующие последовательности по сравнению с некодирующими гораздо более консервативные , экзоны более консервативны, чем интроны .

б) экспериментальный подход- состоит в следующем – выделить РНК, синтезировать на её матрице кДНК и секвенировать её , единственный подход дающий стопроцентную гарантию определения кодирующей последовательности.

Есть несколько экспериментальных методик, связанных с полной или частичной идентификацией гена. Самый старый и самый простой способ – это гибридизация и различные модификации такой методики (либо FISH, либо люминесцентное микроскопирование) позволяют разобраться, где какой ген расположен при условии наличия достаточно подробной физической карты.

Недостаток такой методики заключается в том, что должны быть зонды под каждый ген, прицельные, т.е. их нужно готовить специально.

Вариант гибридизации, так называемый зоо-блоттинг, не предусматривает приготовления отдельных зондов под каждый из генов. Здесь метится сразу вся ДНК. Идея: за счет того, что более консервативна кодирующая последовательность, чем некодирующая, гибридизоваться будут именно гены. Межгенные участки гибридизоваться не будут.

Наиболее полезные методики, которые направлены на прицельное экспериментальное определение кодирующих последовательностей сводятся к секвенированию кДНК, потому что оно сразу дает информацию о большом количестве процессированных транскриптов и промежуточных продуктах процессинга

для идентификации кодирующих последовательностей применяют сложные алгоритмы:

• наиболее надежными являются программы , использующие все доступные критерии кодирующих и регуляторных последовательностей

• для интегральной оценки данных большинство таких программ используют скрытые марковские модели генов или искусственные нейронные сети (Ценность нейронной сети зависит от того, насколько хорошо программист написал программу, и от качественности набора экспериментальных данных на стадии тренировки)

Правильное название – «искусственные нейронные сети», т.е. симулирующие реальную нейронную сеть биологических процессоров, которые связаны друг с другом отростками: аксонами на более длинные расстояния, дендритами – на короткие. Вместо отростков нейронов используются логические соединения, выражаемые в коэффициентах. В самом простом случае нейронная сеть состоит из двух слоев нейронов.

Помимо нейронных сетей есть еще один интересный алгоритм, который основан на так называемых спрятанных цепях Маркова (этот математический аппарат разработан советским математиком).

Если надо найти ген в геноме организма, принадлежащего хотя бы классу, в котором есть один законченный геном, практически любая из указанных программ достаточно надежно с задачей справится (с вероятностью порядка 90-95%, а это для эукариотического генома хорошо).

№ 12 Молекулярная база данных-это коллекция данных ( последовательностей) , которые упорядочены, аннотированы, индексирован ( приспособлены к поиску), регулярно обновляются, имеют перекрестные ссылки

Они нужны для :

Обеспечивают взрывоопасный рост объема информации

Многие экспериментальные данные не публикуются в литературе, их можно найти только в базе данных

Позволяют использовать мощные инструменты в биологических исследованиях

GenBank – основная нуклеотидная база данных

• Создана в 1979 году

• 112 326 229 652 –нуклеотидов

• 116 461 672 –н.п

Swiss-Prot-наиболее информативная белковая база данных

• Создана 1986 году

• Практически нет дупликаций

• Перекрестные ссылки на 55 других баз данных

• Качественная аннотация : штат аннотаторов, более 200 квалифицированных внешних экспертов

Ошибки в базах данных :

1. Ошибки аннотации : неточность, неполнота , несоответствие различных полей

2. Ошибки секвенирования : замены нуклеотидов, свдиг рамки считывания, крупные делеции из-за поворотов

Избыточность баз данных :

1. Многие последовательности частично или полностью дуплицированы – 20% последовательностей позвоночных в GenBank

2. Дублированные последовательности часто имеют отличия

№13 Две задачи функциональной геномики(доработать)

1. выяснить функции каждого структурного компонента генома

2. исследовать , каким образом геном организма обеспечивает его функционирование как целостной системы

два типо методических подходов:

• тотальный – одновременные количественные изменения всех транскриптов или белков или метаболитов организма

• индивидуальный – инсерционная инактивация , сайленсинг или сверхэкспрессия отдельных генов с последующим исследованием фенотипа организма

методы индивидуального подхода

1. прямая генетика ( получение набора мутантов , анализ их фенотипов и идентификация мутироваашего гена)

основной подход – транспозоновый мутагенез:

• транспозон несет селективный маркер

• для многих транспозонов после мутагенеза в генома присутствует только 1 копия транспозона

б) обратная генетика ( получение мутации конкретного гена с последующим поиском фенотипа)

№ 16 Эволюция геномов. Механизмы геномных перестроек, увеличения и уменьшения

размеров геномов. Семейства гомологичных генов. Ортологи и паралоги. Псевдогены.

От одноклеточной эукариотической клетки до человека получается стократное увеличение генома , с 2 млн до 3 млрд нуклеотидных пар

У сложных растений геном может быть больше, чем у человека

Эволюция идет на уровне генов , но гораздо четче прослеживается в нуклеотидной последовательности .

С развитием молекулярной генетики и расшифровкой отдельных генов и целых геномов стало ясно, что дивергенция – это основное направление эволюции

Конвергенция (схождение признаков)

Паралле­лизм- причиной параллелизма может быть относительно высокая вероятность сходных мутаций одних и те же генов.

II Механизмы геномных перестроек

• Дупликация- удвоение участка хромосомы, содержащего гены

• Инверсия -  хромосомные перестройки, связанные с поворотом отдельных участков хромосомы на 180°

• Делеции- хромосомные перестройки, при которых происходит потеря участка хромосомы.

• Транслокации - тип хромосомных мутаций. В ходе транслокации происходит обмен участками негомологичных хромосом, но общее число геновне изменяется.

Ортологи и парологи

Обычно при сравнении нуклеотидынх или белковых последовательностей термин « гомологи» не используется, так как мы не можем говорить о гомологии без достаточных на то оснований, поэтому используется термин ортологи – те гены, которые сходны и выполняют те же функции, парологи – сходные гены , которые возникли в результате внутригенной дупликации и выполняют разные функции.

Псевдогены -неактивные, но стабильные элементы генома , возникшие в результате мутаций в ранее работающем гене.

Псевдогены (англ. pseudogenes) — нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке^[1]. Термин «псевдоген» был впервые предложен в 1977 году^[2]. Некоторые псевдогены могут копироваться из мРНК и включаться в хромосомы, такие последовательности называютсяпроцессированными псевдогенами (ретропсевдогенами)^[1]. Тем не менее, они также нефункциональны. Псевдогены происходят от обычных функциональных генов, однако утрачивают способность экспрессии в результате мутаций (появление стоп-кодонов, сдвиг рамки считывания и т. п.)^[3].

Число процессированных псевдогенов (ретропсевдогенов) в среднем больше, чем предковых функциональных генов. Иногда число процессированных псевдогенов может превосходить число соответствующих функциональных генов на несколько порядков. Один из примеров — семейство Alu-повторов, содержащих характерный сайт рестрикции Alu1-эндонуклеазы^[1][3][4].

Анализ генетической последовательности псевдогенов и сравнение их с предковыми генами может быть использовано при изучении родственных связей между различными видами живых существ и их происхождения^[3].

№17 . Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно.

Дупликации. Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно. Повторы в геномах можно классифицировать по-разному:

(1) Некоторые геномы сами являются дупликациями.

(2) Сегментарные дупликации, особенно выраженные в геноме человека. Некоторые из этих дупликаций связаны с геномными болезнями.

Сегментарные дупликации занимают 3.3% генома человека

(3) Дупликации генов и генные семейства.

(4) Множественные копии мобильных элементов.

(5) Простые повторы (короткие, от 1 до нескольких десятков нуклеотидов, в том числе микросателлиты и минисателлиты , которые по-видимому, не кодируют никаких продуктов.

(6) Блоки тандемно повторенных последовательностей, такие как последовательности в центромерах, теломерах, коротких плечах акроцентрических хромосом, кластеры рибосомальных генов.

(7) Инактивированные ретротранспозированные копии генов.

(8) Внутрибелковые повторы .По частоте встречаемости различают низкокопийные (примерно до 10 копий), умеренно повторяющиеся последовательности (от 10 до 10⁴), часто повторяющиеся последовательности (более 10⁵). По типу следования различают диспергированные и тандемные повторы.

Геном человека известен на 94% .На основании этого материала можно сделать следующие выводы. Повторы занимают по крайней мере 50% генома. В геноме человека (и млекопитающих) встречаются мобильные элементы четырех типов.

Количество повторяющихся последовательностей в геноме человека составляет около 50 % всего генома, тогда как количество генов, кодирующих белки примерно на порядок меньше.

В то же время очевидно, что повторы несут какую-то важную функцию, не связанную с кодированием белков, так как они повсеместно встречаются и, по многочисленным данным, участвуют во многих процессах, обуславливающих экспрессию генов, рекомбинацию, мутагенез, клеточное старение…

Было предложено большое количество гипотез для объяснения наличия этого странного феномена, но ни одна из них до конца не объясняет всех обнаруженных фактов.

Наиболее распространёнными на сегодня являются гипотеза о паразитическом происхождении таких последовательностей, гипотезы об их участии в структурной организации хромосом, участии в механизмах клеточного старения, резерве ДНК, участии в мутагенезе и тому подобное.

Предлагается к обсуждению гипотеза о том, что повторяющиеся последовательности несут одну из важнейших функций в геноме – кодирование и передачу количественной информации.

То есть, повторяющиеся последовательности ДНК представляют собой числа, закодированные в единичной системе счисления.

№ 18 Мобильные элементы эукариот

Стандартно, есть средняя часть, которая кодирует ген, содержащий необходимый для перемещения фермент - транспозазу. Центральная часть обычно ограничена набором повторов , чаще всего относительно длинные инвертированные повторы с прямыми поворотами по концам

Любой домен, который обеспечивает перемещение мгэ, разрезает ДНК в точке инсерции транспозона –ступенчато, размер ступеньки –разнообразный. У нас получаются липкие концы, затем к ним присоединяется транспозон , а бреши застраиваются стандартной системой репарации. Мы получаем дуплицированные последовательности липких концов.

Транспозон –молекула ДНК, которая стремится максимально размножиться, но есть ограничения со стороны бактериальной клетки на увеличение генома ( не хватает Э)

Бактериальные транспозоноы можно классифицировать по нескольким критериям :

• собственно транспозоны ( в состав входят дополнительные гены)

• IS –элементы ( в состав не входит ничего, кроме min набора генов, необходимого для транспозиции)

2 способ классификации :

• Простые транспозоны

• Составные ( составлены из простых мгэ , как правило это IS –элементы) –это искусственное образование может формироваться в любой момент

Транспозиция бывает

А) прямая ( перемещается сам транспозон)

Б) инвертированная ( перемещается часть плизмиды, которая ограничена IS –элементом)

в геном каждой бактерии входит около десятка IS –элементов. Они различаются по своему размеру, размеру инвертированных поворотов, размеру дупликации в точке инсерции ( обычно 9 пар)

Мобильные генетические элементы (МГЭ, подвижные элементы, транспозируемые элементы, транспозоны и т.д.)

№19 мобильные элементы прокариот

Интересно, что для ДНК эукариот характерно присутствие нескольких версий ДНК –транспозонов. В состав кажого транспозона входит несколько семейств:

• Автономный -полноразменрый транспозон, который может перемещаться самостоятельно

• Неавтономный – не может перемещаться самостоятельно, но т. к это делеционный вариант того же самого транспозона , то транспозаза распознает их концы –инвертированные повороты, и обеспечивает их перемещение

Ретротранспозоны – важнейший класс МГЭ , размножаются в такой степени, что занимают значительную часть генома

Механизм перемещения ретротранспозонов

• Классический ретровирус ,при заражении кл-ки его ДНК , попадает в клетку, далее идет синтез кДНК копии, она становится 2цепочечной, и такая ДНК ретровируса встраивается в геномную ДНК клетки, затем идет транскрипция этой ДНК, синтез белков, упаковка вирусных частиц и цикл инфекции повторяется

Ретротранспозоны представлены РЕТРОВИРУСОМ и НЕРЕТРОВИРУСОМ

РЕТРОВИРУСЫ – имеют длинные концевые повторы, фермент , который участвует в перемещении – интеграза

НЕРЕТРОВИРУСЫ –нет повторов , фермент –нуклеаза

№ 20 Горизонтальный перенос генов

Геномы прокариот подвержены быстрым изменениям в результате горизонтального переноса ДНК

Размер и структура генома близкородственных видов и даже штаммов одного вида бактверий могут существенно различаться в результате чрезвычайно активных процессов горизонтального переноса

Механизмы горизонтального переноса

• Трансдукуия вирусами бактерий ( бактериофагами)

• Коньюгация – перенос плазмид из одной клетки в другую

• Трансформация – поглощение бактериальными клетками « свободной» ДНК

Динамичность генома энтеробактерий обусловлена большим набором « необязательных» компонентов, способных свободно перемещаться между геномами, занимающих одну нишу видов

Представители семейст Entereobacteriaceae имеют геномы размером около 5 млн. н.п , содержащие около 5 тыс генов

Значительная часть генома входит в состав хромосомных островов патогенности или расположена в ДНК фагов или плазмид, набор которых сильно отличается даже у разных штаммов одного вида

Острова патогенности -интегрированная бактериофагом плазмида или фрагмент ДНК , ограниченный с 2 сторон транспозонами из встроенных геномов

Легкость горизонтального переноса и сильное эволюционное давление на минимализацию генома приводят к тому, что геном отдельной бактерии может не модержать весь набор генов , необходимый для нормального существования вида бактерий

Пангеном – совокупность всех генов одного вида бактерий, которые могут быть скомбинированы в геном одной клетки за счет механизмов горизонтального переноса.

№ 21 Хромосомы про- и эукариот: форма, количоство, структурные элементы, обеспечивающие стабильность и репликацию.

Как у прокариотических, так и у эукариотических организмов гены располагаются группами на отдельных молекулах ДНК, которые при участии белков и других макромолекул клеток организуются в хромосомы

Хромосомы эукариот имеют сложное строение. Основу хромосомы составляет линейная макромолекула ДНК значительной длины . В растянутом виде длина хромосомы человека может достигать 5 см. Помимо неё, в состав хромосомы входят пять специализированных белков — H1, H2A, H2B, H3 и H4 (так называемые гистоны) и ряд негистоновых белков

Макромолекула ДНК обвивает октомеры (структуры, состоящую из восьми белковых глобул) гистоновых белков H2A, H2B, H3 и H4, образуя структуры, названные нуклеосомами. В целом вся конструкция несколько напоминает бусы. Последовательность из таких нуклеосом, соединённых белком H1, нуклеосомной нитью, диаметром около 10 нм.

В ранней интерфазе (фаза G1) основу каждой из будущих хромосом составляет одна молекула ДНК. В фазе синтеза (S) молекулы ДНК вступают в процесс репликации и удваиваются. В поздней интерфазе (фаза G2) основа каждой из хромосом состоит из двух идентичных молекул ДНК, образовавшихся в результате репликации и соединённых между собой в районе центромерной последовательности.

Перед началом деления клеточного ядра хромосома, представленная на этот момент цепочкой нуклеосом, начинает спирализовываться, или упаковываться, образуя при помощи белка H1 более толстую хроматиновую нить, или хроматиду, диаметром 30 нм. В результате дальнейшей спирализации диаметр хроматиды достигает ко времени метафазы 700 нм. Значительная толщина хромосомы (диаметр 1400 нм) на стадии метафазы позволяет, наконец, увидеть её в световой микроскоп. Конденсированная хромосома имеет вид буквы X (часто с неравными плечами), поскольку две хроматиды, возникшие в результате репликации, по-прежнему соединены между собой в районе центромеры

• Вся генетическая информация прокариот содержится в одной молекуле ДНК, имеющей форму ковалентно замкнутого кольца и получившей название бактериальной хромосомы . (В прокариотной клетке ДНК может находиться и вне бактериальной хромосомы - в плазмидах , но последние не являются обязательными клеточными компонентами).

Длина молекулы ДНК в развернутом виде может составлять более 1 мм, т.е. почти в 1000 раз превышать длину бактериальной клетки. Длительное время считали, что в распределении нитей ДНК бактериальной хромосомы не прослеживается никакой закономерности. Однако если исходить из того, что молекула ДНК образует беспорядочный клубок, трудно объяснить процесс репликации и последующее распределение образовавшихся хромосом по дочерним клеткам.

Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах величины (1-3), умноженной на 10 в степени 9 Да. В группе микоплазмгенетический материал представлен молекулами, имеющими наименьшее для клеточных организмов количество ДНК: (0,4-0,8), умноженное на 10 в степени 9, а наибольшее содержание ДНК обнаружено у нитчатых цианобактерий (8,5, умноженное на 10 в степени 9). Хотя каждая прокариотная клетка содержит 1 хромосому, часто в экспоненциально растущей культуре количество ДНК на клетку может достигать массы 3, 4, 8 и более хромосом. Нередко в клетках при действии на них определенных факторов (температуры, рН среды, ионизирующего излучения, солей тяжелых металлов, некоторых антибиотиков и др.) происходит образование множества копий хромосомы. При устранении воздействия этих факторов, а также после перехода в стационарную фазу в клетках, как правило, обнаруживается по одной копии хромосомы. Следовательно, термины "нуклеоид" и "хромосома" не всегда совпадают. В зависимости от условий нуклеоид прокариотной клетки может состоять из одной или некоторого числа копий хромосомы

№ 22 структура гена

Экзон - интронное строение присуще всем эукариотическим генам, у бактерий и внеклеточных организмов — вирусов они встречаются только как исключение. 

Интроны имеют разные размеры – от 100 п.н. до 10 т.п.н. Интроны имеют очень большую протяженность, а экзоны составляют очень небольшую часть гена. В зрелой молекуле мРНК интроны отсутствуют, а экзоны составляют непрерывную кодирующую последовательность. Поэтому размеры зрелых мРНК эукариот в десятки раз меньше первичных РНК-транскриптов и размеров самого гена.

Экзоны – это кодирующие последовательности ДНК генов эукариот, представленные в зрелой молекуле РНК. Интроны – это некодирующие участки генов эукариот, которые транскрибируются, но затем вырезаются из первичного транскрипта во время сплайсинга и не входят в состав зрелых РНК, т.е. не транслируются.

Не все гены эукариот содержат интроны. Не содержат интронов гены:

• Гистоновых белков

• мяРНК

• α - и β – интерферонов

• митохондрий млекопитающих и человека

№ 23 Организация оперонов у про- и эукариот. Проблема экспрессии внутренних генов

оперонов эукариот и молекулярный механизм ее решения.

Со строением оперонов и принципом регуляции экспрессии входящих в них генов можно ознакомиться на примере лактозно- го оперона (рис. 1.4). Этот оперон состоит из трех генов — lacZ, lacY и lacA, продукты которых — Р-галактозидаза, Р-галактозид- пермеаза и Р-галактозидтрансацетилаза, соответстьенно, — необ­ходимы для использования лактозы в качестве источника углеро­да. Оперон имеет один промотор и перекрывающийся с ним оператор, а такжз один основной терминатор транскрипции, по­этому все входящие в него гены транскрибируются в одну поли­генную молекулу мРНК. На ней одновременно синтезируются все три белка, так как каждый входящии в нее ген обладает собствен­ным сайтом связывания рибосом. Одновременно при необходимо­сти прекращается и экспрессия всех генов оперона осуществляется путем посадки молекул репрессора на оператор. Ген lad репрессора лактозного оперона, расположенный рядом, экспрессируется конститутивно, так что в отсутствие лактозы оперон не фун­кционирует (негативная регуляция). Замена Сахаров в среде на лак­тозу приводит к дерепрессии (индукции) оперона, так как она обладает способностью связываться с репрессором и инактивиро- вать его. Таким образом, лактоза является индук ором /аооперона.

Лактозный оперон является объектом и позитивной регуля­ции, осуществляемой с помощью другого сайта, который находит­ся рядом с промотором п одинаков для всех оперонов, подвергаю­щихся катаболитной репрессии. Это явление заключается в следующем. Если в среде присутствуют одновременно глюкоза и какие-нибудь другие сахара, то бактерии используют только глю­козу. Индикатором отсутствия в клетке глюкозы является высо­кая концентрация циклического AMP (сАМР), обладающего спо­собностью связываться с бел ком - акти ваторс м катаболизма Сахаров (БАК). Комплекс же АМР- БАК имеет высокое сродство с сай­том позитивной регу,шции оперонов, предназначенных для ката­болизма Сахаров (БАК-сайт). РНК-полимераза связывается с от­носительно слабыми промоторами этих оперонов только во взаимодействии с указанным комплексом, поэтому их транскрип­ция происходит только в отсутствие глюкозы

Регуляция экспрессии оперонов, обеспечивающих синтез ка­ких-либо низкомолекулярных веществ (например, аминокислот), обычно осуществляется конечными продуктами, которые высту­пают в данном случае как корепрессоры. По достижении опреде­ленной концентрации эти продукты объединяются с молекулами репрессоров, способствуя тем самым их связыванию с операторами и блокированию транскрипции оперонов. Некоторые опероны, определяющие синтез аминокислот, дополнительно регулируются с помощью так называемых аттенюаторов.

Рассмотрим принцип их действия на примере триптофанового оперона. Аттенюатор располагается в лидерной части оперона, т. е. между промотором и первым геном. Он представляет собой нукле- отидную последовательность с двумя гомологичными инвертиро­ванными повторами, так что шпильки могут образовываться учас­тками 1 и 2, 2 и 3, 3 и 4, причем шпилька 3:4 является терминатором транскрипции (рис. 1.5), а ее образованию препятствует шпилька 2:3. Лидерная последовательность транскрибиру­ется в лидерпую РНК, содержащую информацию о лидерном пеп­тиде. В участке 1 находятся подряд два трипюфановых кодона, а между участками 1 и 2 распс ложен терминирующий кодон. Поэто­му от наличия или отсутствия в среде триптофан? зависит степень завершенности синтеза лидерного пептида, что в свсю очередь отра­жается на вторичной структуре лидерной РНК. В присутствии трип­тофана завершение синтеза лидерного пептида сопровождается пе­редвижением рибосом в участок 2. Это способствует образованию шпильки 3.4, благодаря чему аттенюатор приобретает свойства тер­минатора транскрипции и гриптофановая мРНК не обпазуется. В противном случае рибосомы "застревают" в участке 1 и по кине­тическим причинам шпилька 2:3 образуется предпочтительнее, чем 3:4. Поэтому РНК-полимераза продвигается за аттенюатор и образует полноразмерный транскрипт оперона.

Регуляция на уровне трансляции встречается реже, чем на уровне транскрипции. В этом случае заметную роль играю- трансляцион­ные репрессоры. Одним из примеров являются антисмысловые РНК (асРНК).

№ 24 Концепция минимального генома. Природные минимальные геномы бактерий, архей,

эукариот -их размер, число генов, особенности организации.

Определение минимального размера генома, обеспечивающего все необходимые функции, которые позволяют одноклеточному организму существовать в определенных экологических условиях, не является праздным вопросом. Решение этой проблемы необходимо для понимания происхождения жизни на Земле, а также путей и механизмов совместного эволюционирования генов, объединенных в конкретные геномы, а следовательно, и механизмов возникновения геномов как таковых

• Геном кишечной палочки

Размер 4.6 млн н.п

Число генов, кодирующих белок 4300

Число генов, кодирующих РНК 116

• deinococcus radiodurans

3 284 156 н.п в 4 репликонах

67 % ГЦ

91% кодирующей белок ДНК

Устойчивость к повреждению ДНК определяется : высоким содержанием ГЦ пар, присутствие генов для всех систем репарации ДНК,полиплоидностью ( 4-10 копий генома в клетке)

• Самый маленький бактериальный геном у патогенна человека Mycoplasma genitalium

Размер 580 т.н.п

Число генов, кодирующих белки -470

Число генов, кодирующих РНК 43

• Самый маленький геном архей –у патогенна другой археи Nanoarchaeum equitans

Размер 490 т.н.п

Число генов, кодирующих белки -552

Cредний размер гена 827 н.п

5% -некодирующей ДНК

• Самый маленький бактериальный геном у Carsonella rudii, облигатного эндосимбионта листоблошки

Размер 159.662

213 генов ( 182 кодируют белки)

№ 25 . Характерные черты геномов прокариот.

Прокариоты – микроскопические одноклеточные организмы, с min морфологическим разнообразием

Основные свойства прокариот :

• Компактность ( min некодирующей ДНК 5-10% ; в основном без интронов)

• Высокая мобильность за сет горизонтального переноса

• Геном представлен однокольцевой или линейной хромосомой размером 0.5 – 10 м н.п, могут иметь несколько кольцевых или линейных плазмид ( плазмиды отличаются от хромосомы тем, что она может быть утрачена без потери клеткой жизнеспособности)

Плазмиды имеют размер от нескольких тысяч до десятков тысяч нуклеотидных пар

• Средний размер гена -1т.н.п

• Обычное кол-во генов 3-5 тыс

• Размер генома 2-5 млн н.п

Традиционно бактериальные геномы представляются в виде колец

Первые 2 кольца – ГЦ –перенос – показывает в какую сторону транскрибируется большинство генов и позволяет определить точку начала инициации и репликации , а так же точку терминации репликации

Формула для ГЦ переноса : (% Г пар -% Ц пар) / сумма % ГЦ пар показывает насколько богата ГЦ парами часть генома

Третье кольцо –ГЦ состав ( суть –показать фрагменты ДНК, которые имеют чужеродные происхождения)

• САМЫЙ БОЛЬШОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКИЙ ГЕНОМ У SORANGIUM CELLULOSUM

Размер 13,033 779 н.п ( одна кольцевая хромосома )

Содержание ГЦ пар -71.38 %

Max размер гена 25.254 н.п

Средний размер гена 1206.05 н.п

Число генов , кодирующих белки -9.367

№ 26 Характерные черты геномов факультативных и облигатных патогенов. Взаимная

адаптация геномов патогена и его хозяина.

Структура геномов факультативных и облигатных патогенов принципиально отличается

	Геном факультативного патогенна	Облигатного патогенна
Размер	Большой ( более 5 млн н.п)	Небольшой ( 0.5 -2 млн н.п)
Метаболические возможности	Разнообразные	Ограниченные
Число регуляторных генов	Большое ( сотни)	Маленькое ( единицы, десятки)
Содержание ГЦ пар	Высокое	низкое
Кол-во транспозонов	Десятки , сотни	Единицы

№ 27 Разнообразие и характерные особенности геномов одноклеточных эукариот

• Пивные дрожжи – вегетативное размножение путем деления ( s. Pomble)

• Хлебные дрожжи –почкование ( s. Cerevisiae)

	s. Pomble	s. Cerevisiae
Размер генома	13.8	13.6
Число хромосом	3	16
Число генов, кодирующих белки	4.929	5570
% генов с интронами	43	4
Плотность генов	1/ 2800	1/ 2500
% генома, кодирующего белки	57.5	70
Число генов тРНК	174	275
Число повторов рРНК	120	140
Число транспозонов	11 ( 0.35%)	59 ( 2.4 %)

№ 29 НЕМАТОДЫ

Развитие каждой клетки нематод жестко детерминировано. Геном нематоды ( С.elegans) имеет размер 100млн.н.п

Последовательность генома собрана из :

• число генов 1900

• ген РНК- 877 мРНК

• геном был секвенирован с использованием космид – 17 000 и дрожжевых хромосом -3 000 YAC последовательностей

Доменная организация белков :

1. большинство генов используется в клетках коммуникации ( G –белки, рецепторы)

транссплайсинг -способность считывать информацию со внутренних рамок считывания, путем разрезания по механизму сплайсинга

• в 1 гене – 6 экзонов ( размер 300 н.п) и размер интронов ( 57 н.п)

• средний размер гена – 2 тыс н.п

• 27 % кодирующей ДНК

№ 30 Общие характеристики генома Drosophila melanogastres

• Размер генома -180 млн. н.п ( 120 Mb –эухроматин; 60 –гетерохроматин )

Эухроматин – беден генами , богат транспозонами и др. повторами, интенсивно окрашивается, окружает центромерные области

• Геном богат повторами => используется 3 типа библиотек

А) мультикопийные плазмиды со вставками размеров 2 kb

Б) плазмиды со вставками размером 10 kb

В) 130 kb ВАС-клоны секвенированы с концов и использованы для стыковки фрагментов генома между собоц

• В геноме 14 тыс генов

• Экзонв 4-5 ( размер 150 н.п)

• Интроны ( 60 н.п)

• Средний размер гена 3800 н.п

• 19 % кодирующей ДНК

№ 31 Геном позвоночных

Наиболее подробный, хотя и не всегда правильный анализ генома человека содержится в статьях 2001 года

• 2.85 млрд н.п

• 22-23 тыс кодирующих белок генов

• 10 экзонов на ген ( но 8 % генов без интронов)

• Средняя длина гена 50 т.н.п

• Не менее 40 % генома-интроны

• 5.3 % сегментных дупликаций

№ 32 Сравнительная характеристика геномов Ноmо sарiепs и Рап troglodytes.

Нуклеотидная последовательность на 97.5 % идентична H.Sapiens

Отличия от H. S:

• 35 млн нуклеотидных замен

• 5 млн инсерций/ делеций

• Некоторые хромосомные перестройки

Частота одиночных замен ( SNP) – 1.29 %

29 % белков идентичны, а в среднем по 2 аминокислотные замены на белок

H.Sapiens

• 2.85 млрд н.п

• 22-23 тыс кодирующих белок генов

• 10 экзонов на ген ( но 8 % генов без интронов)

• Средняя длина гена 50 т.н.п

• Не менее 40 % генома-интроны

• 5.3 % сегментных дупликаций

1. Различие между шимпанзе и человеком в связи с однонуклеотидными заменами в среднем составляет 1,23%, из которых 1,06% либо меньше относится к фиксированной дивергенции, а остальное является результатом полиморфизма в пределах популяций шимпанзе и в пределах популяций человека. На процессы вставки и удаления приходится ещё около 3 процентов отличий между последовательностями шимпанзе и человека, но каждый такой процесс воздействует на несколько нуклеотидов. Число генетических изменений в результате этих процессов является частью числа однонуклеотидных замен (примерно 5 миллионов по сравнению с примерно 35 миллионами). Таким образом, описание идентичности человека и шимпанзе на уровне от 98 до 99 процентов вполне уместно (Chimpanzee Sequencing 2005).

2. Различия в измерениях зависят от того, что измеряется. Если измерять число белков, полностью идентичных у двух видов, то человек и шимпанзе идентичны на 29% (Chimpanzee Sequencing 2005). Если измерять различия несинонимичных пар основв белок-кодирующих районах, то человек и шимпанзе идентичны на 99,75 процентов (Chimpanzee Sequencing 2005, рис. 9). Первоначальная оценка в 98,4 процента была получена в экспериментах гибридизации ДНК, в которых измерялись (косвенно, при помощи температуры плавления ДНК) различия последовательностей среди коротких сегментов геномов, которые достаточно подобны для гибридизации, но у них были удалены повторяющиеся элементы (Sibley and Ahlquist 1987). Какой бы метод измерения не использовался, тем не менее, если применять данный метод последовательно, то он покажет, что люди ближе находятся к шимпанзе (включая бонобо, сестринский вид по отношению к обыкновенному шимпанзе), чем к любому другому виду. Следует также отметить, что эволюция не производила равномерного влияния на геном, поэтому оценки дивергенции человека и шимпанзе, относящиеся лишь к части генома, могут дать разные результаты (Britten 2002, Chen et al. 2001).

 Для исследования происхождения человека первоначально использовали сравнение последовательностей ДНК человека и обезьян. Пока, к сожалению, геномы обезьян еще расшифрованы далеко не полностью. Тем не менее, на основании имеющихся данных оценено, что в среднем сходство геномов и количество сходных генов у человека и человекообразных обезьян (шимпанзе) достигает 95–99%, у человека и гиббона — 76%, у человека и макаки-резус — 66%. В то же время ДНК шимпанзе и гориллы имеют между собой 97% сходства. Это говорит о том, что у человека сходство с шимпанзе больше, чем у шимпанзе и гориллы. Используя метод «молекулярных часов», ученым удалось доказать, что от гоминид, т. е. представителей родословной линии человека, человек и шимпанзе разошлись чуть более чем 5 млн. лет назад, в то время как горилла отошла от общей ветви более 7 млн. лет назад (рис. 38). По различиям между полностью известными нуклеотидными последовательностями митДНК людей и шимпанзе было вычислено время первого разделения групп предков ныне живущих людей, которое произошло 180–200 тыс. лет назад. Это дата наиболее древней мутации в митДНК, которую генетики смогли распознать.

№ 33 Отличительные черты геномов растений.

Геномы мнгих С/х растений очень большие :

• Пшеница 12 млрд. н.п

• Кукуруза 2.4 млрд. н.п

• Томат 1 млрд. н.п

• Рис 0.44 млрд. н.п

Руховитка Таля – идеальный объект для исследования , так это

• Компактное растение – обусл-на небольшим размером интронов, и малым размером кодир-й части

• Короткий жизненный цикл

• Самоопыляемое растение

• Дает много семян

• Давно изучается

• Крестоцветное

Геномы растений содержат много микро РНК, а сами гены микро РНК :

• Небольшие ( 70-200 н.п)

• Не кодируют белок

• Сложно обнаружить

• Процессируются с образованием малой интерферирующей РНК, размером 20-21 нуклеотид

Геномы растений насыщены повторами

1. Транспозоны ( широкий спекрт МГЭ различных семейств; могут занимать значительную часть генома)

2. Сателлиты - micro и mini сателлиты могут занимать половину генома

3. Телломерные повторы - теломерные и субтеломерные повторы

4. Центромерные повторы - центромеры и перицентромерные области

5. Повторы генов рибосомной РНК