4. Осаждение белков органическими растворителями

Метод основан на способности органических растворителей нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция происходит лучше в присутствии электролита хлорида натрия вследствие снятия заряда с частиц белка.

Реакция осаждения белка спиртом при кратковременном действии спирта на холоде обратима. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок сохранит нативное состояние и может быть вновь растворим в воде. При длительном воздействии спирта наступает необратимая реакция осаждения, то есть денатурация белка.

К 5 каплям раствора исследуемого белка приливают 20 капель этилового спирта (или ацетона). Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. При стоянии выпадает осадок белка.

Указания к составлению отчета. При составлении отчета указать название веществ, осаждающих белки, характер и цвет осадка, чем обусловлена реакция и ее особенности.

Контрольные вопросы:

1. Какие уровни организации белковых молекул вы знаете?

2. Чем обусловлены реакции осаждения белков?

3. Чем может быть вызвана денатурация белков?

4. В чем преимущество концентрированной азотной кислоты по сравнению с другими минеральными кислотами?

5. Почему при отравлении солями тяжелых металлов пьют молоко и сырые яйца?

Лабораторная работа №6

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Цель работы – освоить метод количественного определения белка в биологическом материале и познакомиться с использованием стандартных тест-систем.

Для количественного определения белков в биологическом материале чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. К азотометрии относится классический метод Кьельдаля и его модификации. Эти методы очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19.

Фотоколориметрические методы основаны на цветных реакциях на функциональные группы белков. Среди них наиболее частое применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот. Биуретовый метод является более специфичным, так как ему не мешают примеси – свободные аминокислоты и фенольные соединения.

Спектрофотометрические методы делят на прямые и косвенные. Последние представляют собой более чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка. Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в УФ-области при 200–220 нм (пептидные группы белка) и при 280 нм (ароматические радикалы аминокислот). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов, однако для их применения необходимо специальное оборудование.

Для рутинных исследований в биологических и медицинских лабораториях в основном пользуются стандартизированными наборами реагентов, так как работа с ними значительно сокращает подготовительную часть работы, существенно повышает правильность определения концентраций и упрощает расчетную часть за счет использования стандарта. Применительно к нашей задаче существует набор для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (Total Protein FL-E – производитель «Витал Диагностикс СПб», использующий стандарт фирмы Sigma).

Метод основан на способности белка образовывать окрашенный комплекс с ионами меди в щелочной среде, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в исследуемом материале.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови.

Реактивы: набор для определения концентрации общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом (Total Protein FL-E «Витал Диагностикс СПб»), в который входит:

1. Концентрат биуретового реактива, содержащий натр едкий 0,5 моль/л; калий-натрий виннокислый 80 ммоль/л; калий йодистый 75 ммоль/л; сульфат меди 30 ммоль/л. Концентрат стабилен в темноте при комнатной температуре. Перед проведением анализа необходимое количество разводят в 5 раз (1 часть концентрата + 4 части дистиллированной воды).

2. Стандарт, содержащий альбумин сывороточный 70 г/л; натрий хлористый 154 ммоль/л. Стабилен не менее года при комнатной температуре.

Оборудование:

1. Фотоэлектроколориметр.

2. Штатив с пробирками.

3. Пипетки на 5 мл и 100 мкл.

Ход работы. Взять три пробирки. В первую пробирку (опыт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл сыворотки или плазмы крови. Во вторую пробирку (стандарт) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл стандарта. В третью пробирку (контроль) поместить 5 мл биуретового реактива и 100 мкл дистиллированной воды. Содержимое пробирок перемешивают, выдерживают при комнатной температуре 30 минут.

Содержимое опытной и стандартной пробирки фотометрируют против контроля при длине волны 540 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см не позже чем через час после начала инкубации.

Указания к составлению отчета. Концентрацию общего белка рассчитывают в г/л по формуле

г/л = (Е_опыт/Е_{стандарт}) × 70,

где Е_опыт – экстинкция опыта,

Е_{стандарт} – экстинкция стандарта,

70 – концентрация белка в стандарте в г/л.

Контрольные вопросы:

1. Какая реакция лежит в основе метода и на чем она основана?

2. В чем преимущество определения концентрации веществ по стандарту перед определением по калибровочному графику?