Лабораторная работа №4

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

Цель работы – освоить метод разделения и идентификации аминокислот с помощью радиальной распределительной хроматографии.

Для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков широко применяют распределительную хроматографию на бумаге – простой, доступный и весьма эффективный метод определения аминокислот.

Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (водной) и подвижной (органической) фазами растворителя. Органический растворитель, передвигаясь под действием капиллярных сил, одновременно увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты, перемещающиеся с различной скоростью. Скорость зависит от химического строения аминокислот, от их способности быстрее растворяться в органическом подвижном растворителе или, наоборот, в менее подвижном – воде. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу до 100^ОС, то есть проводят качественную нингидриновую реакцию на аминокислоты, находящиеся на бумаге. Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом распределения. Коэффициент распределения R_f для аминокислоты определяется по уравнению: R_f = a/b, где a – расстояние, пройденное аминокислотой от места старта до середины пятна, b – расстояние, пройденное фронтом растворителя от места старта до финиша.

Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя и тем больше величина R_f и, наоборот, чем больше растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше R_f. Поскольку отдельные аминокислоты в смеси обладают различной скоростью движения, происходит постепенное их разделение.

Величина R_f, кроме химического строения аминокислот и применяемого растворителя, зависит от сорта хроматографической бумаги, ее плотности и окружающей температуры. Коэффициент распределения R_f является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта. Сравнивая R_f известных стандартных аминокислот с R_f аминокислот, полученными для исследуемой смеси, можно качественно определить состав смеси. Подвергая пятна аминокислот элюированию (растворению) и колориметрированию, можно качественно определить даже крайне незначительные количества аминокислот (до 0,1 мкг).

Исследуемый материал: стандартные растворы аминокислот для хроматографии (в 10 мл растворяют 60 мг глутаминовой или аспарагиновой кислоты, 50 мг лейцина, 40 мг глицина или аланина, или серина), раствор смеси аминокислот.

Реактивы:

1. Растворитель – смесь н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:15:10.

2. 0,1% спиртовый или 0,2% ацетоновый раствор нингидрина.

Оборудование:

1. Хроматографическая бумага.

2. Карандаш.

3. Линейка.

4. Микропипетка или капилляр.

5. Чашка Петри.

6. Сушильный шкаф, нагретый до 100-105^оС.

7. Пульверизатор.

Ход работы. Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со сторонами 12 см (больше, чем диаметр чашки Петри) и делят карандашом по диагонали на 4 сектора. В центре карандашом делают круг – линию старта. В центре круга делают небольшой вырез. На линию старта в трех секторах микропипеткой наносят капли трех стандартных растворов аминокислот, а в четвертом секторе наносят каплю определяемой смеси аминокислот. Карандашом подписывают, в каком секторе находятся какие аминокислоты и смесь. Квадрат подсушивают на воздухе. В центр квадрата вставляют бумажный фитилек 1,5 см высотой.

На дно чашки Петри аккуратно наливают 10 мл растворителя, бумажный квадрат накладывают на края чашки Петри так, чтобы фитилек касался растворителя. Чашку Петри закрывают крышкой, желательно равной по диаметру, и оставляют при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до краев чашки. Затем снимают крышку чашки Петри, отмечают карандашом фронт растворителя во всех четырех секторах и сушат хроматограмму в сушильном шкафу 5-10 минут для фиксации аминокислот и испарения растворителя. Растворитель из чашки Петри сливают в отведенную для этого склянку.

Далее хроматограмму проявляют, осторожно опрыскивая ее в вытяжном шкафу из пульверизатора раствором нингидрина. Снова сушат в шкафу для прохождения нингидриновой реакции и проявления аминокислот-свидетелей в виде отдельных пятен в каждом секторе. Для смеси аминокислот наблюдается несколько окрашенных полос.

Указания к составлению отчета. Нарисуйте или приклейте в тетрадь хроматограмму. Проведите расчеты R_f. На основании значений коэффициента распределения сделайте вывод о качественном составе аминокислот в смеси.

Контрольные вопросы:

1. На чем основано разделение аминокислот в данной работе?

2. Почему для хроматографии используется смесь растворителей?

3. На чем основана нингидриновая реакция, используемая в работе?

4. Что такое коэффициент R_f?