1.3.6 Другие промышленные методы очистки, концентрирования и стабилизации ферментных препаратов

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют.

1.4 Микробиологический и биохимический контроль производства

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивироваиня устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризорованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента. Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры.

Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.

На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Например, в грибных препаратах из поверхностных культур она не должна превышать 1·105 клеток на 1 г препарата. При контроле готовых препаратов на обсеменённость микроорганизмами делают высевы проб от каждой партии на твердые среды (МПА и сусло-агар) в чашки Петри. Заражение выражается количеством микроорганизмов на 1 г препарата. Контроль на зараженность спороносными бактериями проводится путем высева нагретых до 80 °С проб на чашах Петри с агаризорованной средой. Культивирование для выявления бактериального заражения ведут при 37 °С в течение 24 ч, а для грибного – при 30 °С в течение 48 – 72 ч.

В готовых препаратах определяют влажность и активность в стандартных единицах на 1 г препарата.

Технические жидкие и сухие ферментные препараты анализируют на активность ферментов, содержание сухого вещества и в зависимости от назначения на наличие микробного загрязнения. При контроле высокоочищенных препаратов помимо определения загрязненности микробами и активности ферментов проводятся анализы на содержание белка, зольных элементов, углеводов и других специфических свойств ферментов.

Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма.

Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах дается разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.

Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.

Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может быть трёх видов:

- культура, выросшая на твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды.

Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.

Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к следующему:

- освобождение от нерастворимых веществ;

- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;

- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.

Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

Применение ферментных препаратов

Применение ферментных препаратов является лучшим стимулятором роста продуктивности любого процесса, условием улучшения качества конечного продукта и повышения его выхода из единицы перерабатываемого сырья. В хлебопечении благодаря применению липоксигеназы увеличиваются объем, пористость, сладость, продолжительность свежести, в кондитерской — предотвращается кристаллизация сахарозы

В крахмалопаточной промышленности препарат а-амилазы и глюкоамилазы обеспечивает ускорение процесса ферментативного гидролиза крахмала до глюкозы с получением пищевой патоки высоких кондиций, пищевой и медицинской глюкозы и других продуктов. При этом возрастает выход глюкозы из переработанного крахмала картофеля, зерна кукурузы, пшеницы; снижаются потери крахмала; увеличивается количество белка в кормах из отходов перерабатываемой кукурузы.

В виноделии и производстве плодово-ягодных соков прежде всего значительно увеличиваются объемы получаемого сока и его концентрата, достигается высокая степень очистки соков, что важно при их концентрировании и хранении в производстве безалкогольных напитков. Получаются также соки с осадком пектина, что способствует активной эвакуации вредных веществ из кишечника человека.

В сахарной технологии, применяя препарат β-фрукто-фуранозидазы, достигают высокой степени гидролиза сахарозы без вредного оксиметилфурфурола, который образуется в глюкозо-фруктозном сиропе, получаемом кислотным гидролизом с применением высоких температур. Пока этот способ экспериментально применяется только на Московском сахарорафинадном заводе имени Мантулина.

Важное значение имеют научные разработки (к сожалению, пока зарубежные— США, Япония), касающиеся ферментативного гидролиза крахмала препаратом глюкоизомеразы до фруктозы и глюкозы, причем содержание фруктозы на первой ступени составляет 48 %, а после десорбции и элюции — до 90 %. Это экономично не только потому, что фруктоза является ценнейшим средством из всех сахаристых веществ, но и потому, что трудоемкую культуру сахарную свеклу можно заменить злаками, содержащими крахмал,— кукурузой, пшеницей, рисом, уход за которыми требует меньших затрат труда и денежных средств.

В США и Японии половину вырабатываемого сахара уже заменили глюкозно-фруктозным сиропом. Во многих странах Европы его также производят. В нашей же стране уже третий год по лицензии Финляндии строятся два завода и ни один не пущен в эксплуатацию. Серьезные научные исследования в этой области не проводятся, а имеющиеся — ниже уровня передовых зарубежных.

Еще хуже обстоит дело с применением ферментных препаратов в масло-жировой промышленности. Известны положительные результаты использования препарата липазы в производстве жиров, причем процесс осуществляется при обычных температуре и давлении. А между тем используется технология, предполагающая высокие температуру (225 °С) и давление (0,3 МПа и более), что связано с потребностью в катализаторах и дорогостоящей аппаратуре, с небезопасными условиями ее обслуживания.

Эти стратегические направления в сахарной и масло-жировой науке в отраслевых исследовательских и учебных институтах не разрабатываются, а пора бы продумать, на каких заводах, в какие сроки испытать определенные ферментные препараты, определить эффектив ность их действия, побудить заинтересо ванных заказчиков провести их про мышленное испытание и внедрение.

Лучшее положение с производствен и применением ферментных препарате в спиртовой промышленности, где выра батывают и используют их амило- и протеолитический комплексы в 90 % выпускаемой продукции. Большую часть солода заменяют препаратами, экономя зерно посевных кондиций, снижают потери крахмала при солодоращении. Однако в отрасли отсутствуют препараты целлюлолитического действия для гидролиза оболочек злаковых и картофеля. Их применение дало бы возможность заметно увеличить выход этанола и расширить область использования нетрадиционного сырья и вторичных ресурсов. К сожалению, это важное направление в науке не прорабатывается.

В пивобезалкогольном производстве применяются комплексные (амило-, протео- и целлюлолитические) ферментные препараты. Благодаря этому сокращается расход ячменя высоких посевных кондиций (он заменяется рядовым зерном), снижаются потери крахмала при солодоращении. Однако объемы несоложенного зерна в производстве пива еще невелики (15—25 %). В Голландии получена опытная партия пива из 100 % несоложенного сырья.

Большие перспективы в применении препаратов в рыбной и мясо-молочной промышленности. Препараты позволяют смягчать рыбную и мясную продукцию, повышая ее сортность, качество и выход.

По расчетам суммарная эффективность от применения ферментных препаратов в пищевой промышленности может достичь в будущем нескольких десятков миллионов рублей.

Пока мы опережаем передовые в научно-техническом отношении страны (США, Японию, ФРГ и др.) по разработкам в области непрерывного этанольного (спиртового) и ацетоно-бутилового брожения. По этому методу эффективно работают десятки предприятий.

Определены закономерности непрерывного протока в многоступенчатой системе, разработаны условия совмещения непрерывности протока с дробной профилактической стерилизацией аппаратуры в ней. Такое совмещение обеспечивает стерильность непрерывного процесса культивирования микроорганизмов. Достигнуты положительные результаты в непрерывном выращивании дрожжей, бактерий и плесневых грибов при производстве этанола, бутанола, ацетона и отдельных ферментных препаратов.

Вместе с тем приостановлены научные работы, касающиеся непрерывного брожения в производстве пива. Грубые ошибки в обеспечении стерильности процесса на нескольких линиях Москворецкого пивоваренного завода (1974— 1984 гг.) привели к нестандартности конечного продукта по стойкости (7 сут) и демонтажу этих линий. Казалось бы, необходимо изучить причины, устранить их и доработать метод непрерывного брожения. Но проше оказалось все сломать и забыть, чтобы потом начать с нуля. А кто же, на какой базе и за счет чьих кредитов продолжит эти исследования? Повсеместно внедряемые периодические аппараты ЦКБА никогда не смогут заменить непрерывного метода. Жизнь потребует перевода их на непрерывную работу, и чем раньше это произойдет, тем лучше.

По нашим данным, в непрерывном протоке в ЦКБА продолжительность брожения Жигулевского пива составляет 8—9 сут, в то время как в периодически действующей ЦКБА она равна 14 сут, а по нормам в обычных ферментерах без совмещения главного брожения и дображивания — 28 сут.

Казалось бы, есть за что бороться. Однако отечественная и зарубежная наука и практика довольствуются одним совмещением брожения в ЦКБА периодического действия.

Особое место в ускорении научно-технического прогресса отводится мембранной технологии, особенно в пищевых отраслях. Микро- и ультрафильтрование, осмотическая обработка пищевых сред обеспечивают удаление посторонней микрофлоры из водопроводной и минеральной воды, различных соков, экстрактов, сусел, питательных сред и готовых жидких продуктов — виноматериалов, вин, пива, безалкогольных напитков и др. Жидкие среды различными мембранами разделяются по величине молекул. Это дает возможность концентрировать продукты и среды при обычной температуре без термического воздействия на их физиологическое и химическое состояние, т. е. стабилизировать, что позволяет транспортировать их на большие расстояния и хранить без потерь.

В этой области науки и техники мы серьезно отстаем не только от США, Японии, ФРГ, но и от рядовых европейских стран. Главное в том, что не разработаны конкурентноспособные конструкции различной лабораторной и промышленной мембранной аппаратуры. Исследования в пищевых отраслях ведутся разрозненно, малыми силами, по краткосрочным программам, на неудовлетворительной технической базе. Выпускаемые мембраны не обеспечивают всех потребностей заказчика по стойкости материалов и планируемой одноразмерности пор.

Большой недостаток отечественной аппаратуры заключается в ее дороговизне, а также в неспособности совмещать механическую очистку забиваемых осадком пор мембран с фильтрованием через них. Модульное комплектование мембранной аппаратуры не заменит совмещения. И при всем этом имеющуюся такого рода разработку (ВЗИПП) при изготовлении опытного промышленного образца ультрафильтра производительностью 10 м3/ч ГКНТ в 1990 г. не нашел возможным финансировать, чем нанес ущерб пищевой науке.