14. Трансдукция

Трансдукция – перенос ген-й информации от клетки донора к клетке-рецепиенту, который осуществляется фагом. Это явление основанона том, что в процессе размножения фагов в бактериях иногда образуются частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК. Эти частицы – трансдуцирующие. При заражении ими новых клеток они передают им генетические детерминанты предыдущего хозяина. Главн. этап образ таких частиц – процесс упаковки ДНК (спецефич. и не спецефическая трпансдукция).

16. Электрофорез белков и нуклеиновых белков

Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, где каждая из ППЦ мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те бели, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.

17. Жидкостная хроматография: виды, методы, оборудования. Жидк.хром.- один из эффект.методов анализа и разделения сложных смесей. Подвижной фазой явл жидкость. Виды: жидк. Хр. подразд-ют на несколько классов в зависим-ти от типа носителя неподвижн. Фазы. колоночная, распределительная(адсорбционная), ионообменная¸ аффинная, гель-фильтрация. Колоночн.- это, в кот-й ч/з колонку, заполнен-ю неподвижн. фазой пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоки жидкости под давл. P или Fт. Адсорбция в зависимости от относит.полярности сорбента и элюента (подвижн.фаза) подразд-ся на нормальнофазовую(неподвижн.фаза водная (сорбент), а подвижн. (элюент) - орг.растворт-ль.) и обращеннофазную (хр. в обращенных фазах): сорбент – орг. раст-ль или водная орг. смесь. Элюент явл. водным. Ионообменная - разделение основано на разл. способности разделяемых ионов к реак-ии ионного обмена с фиксир-ми. ионами сорбента, образующимися в рез-те диссоциации ионогенных групп последнего. Аффинная- основана на образовании прочной связи со специфич. группами неподвижн. фазы (лигандами, аффинантами). Взаимод. лигандов с разделяемыми вещ-ми основано на биолог. ф-ии последних. Особенно в БТ эффект-на д/выделения ферментов, белков, гормонов. Гель-фильтрация – разделение основано на различиях в размерах молекул, мол. малых размеров проникают в сравнительно тонкие поры сорбента и задерживаюся в них,крупные мол либо не проникают в поры, либо проникают лишь в широкие и проходят колонку с незначит. удерживанием. Примен-ют д/ разделения олиго- и полимеров. Оборудования в современ. ЖХ исп-ют приборы разл. степени сложности – от наиболее простых сис-м до хроматографов высокого класса, снабженных разл. дополнит. устр-ми. Совр. жидкостной хроматограф включ-ет: емкости для элюентов, насосы высокого давления, дозаторы, хроматографич. колонку, детектор, регистрирующ. прибор, сис-му управ-я и матем. обработка результатов.

18. Рестриктазы и их действия. Рестриктазы (эндодезоксирибонуклеазы рестрикции) - ферменты класса гидролаз, узнающие и атакующие определенные послед-ти нуклеотидов в мол. ДНК (сайты рестрикции). Распознования чужеродн. ДНК осущ-ся в спецефич. Нуклеотидных послед-ях (сайтах), кот-е в собствен. ДНК клетки отмечены благодаря модификации (чаще всего метилированию) спец. Ферментами, иногда такой модифицирующей активностью облад-ют и сами рестриктазы. Расщепление ДНК проис-т обычно в пределах сайта узнавания, редко на определенном расстоянии от него, при этом образ-ся фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5’- или 3^’ концами. Р. с одинаковыми сайтами узнавания наз. изошизомерами. Р. Подразд-ся на 3 класса. К 1 кл. принадл-т ферменты, узнающие специфич. послед-ть сайта, но разрывающая нить ДНК в произвольной точке. Ко 2 кл. принадл-т Ф, расщепляющ. ДНК в строго определенной точке к сайту узнавания. К 3 кл. отн-ся Ф промежут. типа, разрывающие нить ДНК в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания. Наибольшее значение им. Р второго Кл, широко применяемые в ген. Инженерии и при установлении структуры ДНК. Эти Ф расщ-ют обе нити ДНК. Их применение позвол-ет вырезать из ДНК опред. фрагменты, а также встраивать их в заданные места векторных мол ДНК, т.е. направленно конструировать мол с новой ген информацией.

19. Ферменты генетической инженерии (кроме рестриктаз). Основные гр. ферментов. Ф, с пом. к-рых, получ-ют фрагменты ДНК (рестриктазы).2. Ф, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы). 3. Ф, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы), 4. Ф, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК (нуклеазы). Полимеразы. ДНК-П не связывается с мол двухцепочечной кольцевой ДНК. Но она соединяется с одноцепочечными формами в кол-вах пропорциональных длине этих участков (около 1 мол на 300 нуклеотидных остатков). Ф сос-т из мономерной полипептидной цепи и им. Трехдоменную структуру. Ккждый домен обладает своей ферментативной активностью:15 -3 –полимеразная активность(ПА). Для р-ии необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплиментарного участку этой цепи олигонуклеотида-праймера. (затравки) с 3-ОН-концом 2. 3-5-экзонуклеазная (корректирующая) активность. Гидролизует одно- или двухцепочечную ДНК с 3-ОН-конца. 3. 5-3-экзонуклеазная активность. Деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК с 5-конца. Обр. транскриптаза исп-ся для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. Обратная транскриптаза сос-т из 2х субъединиц – а и b. Обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями. Обр. транскриптаза исп-ся для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. 1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК. 2) активность РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- и двухцепочечную РНК. 3) ДНК-эндонуклеазной активностью. Лигазы ДНК-лигаза катализирует синтез фосфодиэфирной связи в двухцепочечной молекуле нуклеиновой кис-ты, т.е. ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь м-у остатками сахаров. В ген. Инженерии исп-ся 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия: ДНК-лигаза Е. coli ДНК-лигаза фагаТ4. Лигаза фага Т4 более универсально, т.к. помимо лигирования липких концов способна катализировать р-ю воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она исп-ся чаще. Нуклеазы применяются для удаления 3 и 5 выступающих концов ДНК и РНК, разрезания петель шпилек, транскрипционного картирования, вырезания ген-кодирующих последовательностях из геномной ДНК, создания новых сайтов рестрикции.