Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия

Фазово-контрастная и интерференционная микроскопия основаны на явлениях преломления и дифракции видимого света. Основным достоинством этих способов микроскопирования является возможность наблюдать живые клетки и их движение.

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани и клетки. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных клеток и микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

За изобретение фазово-контрастной микроскопии его автор голландский физик Цернике был удостоен Нобелевской премии.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

1). набора объективов со специальными фазовым пластинками; 2). конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов; 3). вспомогательного микроскопа.

Инвертированные микроскопы

Специализированные микроскопы, предназначенные для работы в режиме фазового контраста, их используют главным образом для наблюдения культур клеток, и они позволяют видеть изменения клеток в процессе культивирования. Эти модели микроскопов адаптированы для наблюдения клеток в чашках Петри, в сосудах Карреля и других культуральных сосудах. Инвертированные микроскопы имеют обратное расположение оптики - объективы находятся снизу, а конденсор – сверху.

Направление хода лучей, прошедших сверху вниз через объектив, изменяется системой зеркал, и в глаз наблюдателя они попадают, как обычно, снизу вверх. Микроскопы этого типа предназначены так же для исследования громоздких объектов, которые трудно или невозможно расположить на предметных столиках обычных микроскопов.

Интерференционная микроскопия

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей , которая выражается формулой  = N = (n₀ — n_m)d, где n₀, n_m — показатели преломления частицы и окружающей среды, d — толщина частицы, N — т. н. порядок интерференции,  — длина волны света.

Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста — оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток (и часто применяются именно с этой целью).

Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью (до ¹/₃₀₀ ) измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Это открывает широкие возможности количественных исследований — на основании таких измерений могут быть рассчитаны общая масса и концентрация сухого вещества в микрообъекте (например, в растительной или животной клетке), показатель преломления и размеры объекта. Метод интерференционного контраста часто сочетают с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете; применение его совместно с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, например, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.

Интерференционная микроскопия дает изображение, как будто объект освещен сбоку, изображение формируется как сочетание свет-тень. Имеют значение даже небольшие различия в коэффициентах преломления и толщине участков объекта. Позволяет изучать крупные органоиды. Оптика Номарского – специальная призма, улучшающая качество изображения в интерференционном микроскопе.

Микроскопия в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) – другой способ наблюдения неокрашенных препаратов.

Метод наблюдения в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) служит для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в разных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. По таким изменениям можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.