8. Красители

Уксусно-кислый кармин (УКК). Наиболее удобная краска для метацеркарий трематод, дающая хорошие и константные результаты.

Краситель представляет собой насыщенный раствор кармина в 45%- ном растворе уксусной кислоты. Его говорят растворением кармина (количеством зависит от марки кармина) при кипячении на водяной бане, лучше с обратным холодильником. После охлаждения раствор сливают с осадка, дают отстояться и фильтруют. Для приготовления рабочего раствора полученный концентрированный раствор разбавляют 45-ной уксусной кислоты в соотношении 1:1, или 1:1,5. Если в колбе, в которой кипятился раствор, остался большой осадок кармина, ее вновь заливают 45%-ной уксусной кислотой и снова кипят. Полученный раствор используются без разбавления.

Для окраски половозрелых трематод, например выращенных в эксперименте из метацеркарий, можно рекомендовать борный или квасцовый кармины Гренахера.

Борный кармин Гренахера (спиртовой). 1г. кармина и 4г. алюмокалиевых квасцов растворяют в 100см³ воды, кипят на водяной бане 20 минут, после охлаждения фильтруют. Можно добавить кристаллик тимола от плесени. После окраски соляно-кислым спиртом дифференцируют.

Нейтральный красный. Применяют в качестве витального красителя. Говорят розовый раствор на дистиллированной воде. Каплю такого раствора подпускают под покровное стекло с живыми метацеркариями и выдерживают некоторое время.

8. Среды для эксцистирования метацеркарий

Искусственный желудочный сок. В 1 литр дистиллированной воды растворяют 11 см³ концентрированной соляной кислоты, 7 г. пепсина и 9 г. поваренной соли.

Измельченную мышечную ткань рыбы заливают десятикратным объемом сока и ведут переваривание при 36-37°С в течение трех часов.

Раствор трипсина. Для разрушения оболочек цист, особенно гиалиновых, которые не перевариваются желудочным соком, применяют 0,5% -ный раствор трипсина на физиологическом растворе.

Антиформин. Готовят два раствора.

1. 100,0 г. свежей хлорной извести размешивать в течение 15 минут со 170,0 мл. воды.

2. 70,0 г. кальцинированной соды растворить в 170,0мл. воды.

Оба раствора слить и тщательно размешать. Масса сперва густеет, затем разжижается. Дать отстояться. Отфильтровать через полотняный фильтр. Всю операцию вести под тягой. Полученную жидкость хранить в холодильнике в банке темного цвета.

Небольшие порции цист помещают плотной кучкой в часовое стекло в небольшом количестве воды. Под контролем бинокуляра сверху капают 1-2 капли антиформина. В свежем растворе растворение гиалиновых оболочек идет очень энергично. Цисты, стенки которых частично растворились, следует немедленно перенести в чистую воду и потом иглами удалить остатки оболочки. Если упустить время, то после растворения оболочек начинает растворяться и само тело метацеркарии.

Рис. 8 -

Метацеркарии в антиформине гибнут. Они пригодны для морфологических исследований и для приготовления препаратов, но не пригодны для биологических экспериментов.

2. Методика исследования инвазионных заболеваний рыб

Для исследования отбирают из водоема по 10-15 экземпляров живых или свежих рыб каждого вида. Регистрируют дату, вид рыбы, название водоема. Проводят наружный осмотр чешуи, кожи, плавников, жабр. С этих участков делают соскобы и компрессорным методом просматривают их под микроскопом. Ножницами разрезают брюшко от анального отверстия до области сердца. С помощью лупы рассматривают сердце, гонады, печень, селезенку, почки, кишечник, серозные покровы, плавательный пузырь. Каждый орган отдельно помещают в чашку Петри или на часовое стекло. С каждого органа берут ножницами небольшие кусочки (3-5 мм), помещают на предметные стекла, просматривают под микроскопом на наличие личинок трематод и устанавливают вид метацеркариев.

Исследуют мускулатуру рыб, для чего скальпелем разрезают кожу, начиная от головы, и берут кусочки с поверхностных участков мышц и соскобы с кожи (личинки обычно локализуются в мышечной ткани на глубине 2,5-3 мм). Кусочки мышц помещают на предметные стекла или компрессорий и просматривают под микроскопом.

В мускулатуре рыб паразитируют метацеркарии трематод патогенные и непатогенные для человека и животных. Патогенные для человека и животных метацеркарии (описторхисы, меторхисы, клонорхисы, псевдамфистомы) находятся в цистах, характерно наличие у них двух присосок и черного экскреторного пузыря овальной или грушевидной формы, занимающего 1/3 или 1/4 тела личинки. В цистах личинки активно подвижны. Непатогенные метацеркарии — личинки из рода буцефал и рипидокотил. У них имеется одна крупная присоска с пальцеобразными выступами, экскреторный пузырь зигзагообразной формы занимает до 2/3 тела, они слабоподвижны в цистах. Для метацеркариев параценогонимусов характерна более черная экскреторная система с тремя белыми щелевидными просветами.

Для определения жизнеспособности личинок трематод извлекают из органов и тканей рыб, помещают в подогретый до 40°С физиологический раствор, в искусственный желудочный сок (100 мл 0,5%-ного раствора NaCl, 0,5 г пепсина, 0,75 мл 35%-ного раствора соляной кислоты), под лупой осторожно раздражают личинку препаровальной иглой. Наличие даже слабых движений указывает на то, что они живые. Личинок, извлеченных из органов и тканей рыб, освобождают от излишков ткани, кладут на стекло и окрашивают. На препарат наносят 2 капли 3%-ного раствора розоловой кислоты на 70%-ном спирте на 2 мин, добавляют каплю 0,1%-ного раствора едкого калия и еще оставляют на 2 мин. Излишек краски смывают физраствором, препарат высушивают полоской фильтровальной бумаги, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Мышечная ткань и мертвые личинки окрашиваются в розовый цвет, живые личинки не окрашиваются.

Жизнеспособность личинок можно определить под микроскопом с подогревательным столиком при 36-37°С. Выделенных личинок переносят на столик, добавляют 2-3 капли желчи или 0,5%-ного раствора трипсина. Живые личинки через 5-10 мин выходят из цист. Можно также поместить личинку в каплю физраствора и под контролем микроскопа освободить ее от наружной оболочки с помощью препаровальной иглы. Наличие движений у личинки указывает на ее жизнеспособность.

Если трудно установить вид метацеркария, то личинку освобождают от оболочек механическим или химическим путем. Механически оболочку разрывают препаровальными иглами под контролем лупи. Химическим — измельченные кусочки поверхностных мышц рыб (0,3х0,5 см) в количестве 10-15 г помещают в искусственный желудочный сок в соотношении 1:10, ставят в термостат при 37-40°С на 2-3 ч, затем процеживают через марлю. Осадок переносят в чашку Петри, цисты вылавливают пипеткой при проходящем свете под лупой или под микроскопом, или, добавив Физраствор круговыми движениями чашки отмывают цисты и они концентрируются в центре чашки. Раствор с края осторожно отсасывают резиновой грушей. Промывают до полного удаления остатков мышечной ткани. Для освобождения от внутренней оболочки цисты помещают в теплый 22-24°С раствор трипсина и поваренной соли (на 100 мл 1%-ного раствора NaCl берут 1 г трипсина). Метацеркарии трематод, освобожденные от оболочек, имеют характерные признаки, что служит критерием их видовой принадлежности.

В таблице представлены морфологические признаки личинок трематод, паразитирующих у рыб.

Таб.1

Диагностические признаки личинок трематод (метацеркариев) рыб опасных для человека и плотоядных животных
№ п/п	Виды метацеркариев	У каких видов рыб паразитируют	Локализация в организме рыб	Pазмеры мм, форма цист	Количество оболочек у цисты, их строение	Форма экскреторного пузыря	Наличие присосок и их форма	Подвижность личинки в цисте	Личинки, освобожденные из цисты: размеры, мм; форма тела
1	Opisthorchis felineus	Язь, елец, чебак, плотва, лещ, усач, густера, подуст, жерех, уклея, синец, чехонь, красноперка, сазан, линь	Мышечная ткань, подкожная клетчатки	0.23 — 0.38 х 0,18 — 0,28, овальные, реже круглые	Две, наружная и внутренняя	Почковидная, занимает 1/3 тела личинки	Две круглые, ротовая — 0,088 мм, брюшная — 0,077	Подвижная	0,20 — 0,26 х 0,12 — 0,22, веретенообразная
2	Metorchis albidus	Язь, плотва, красноперка, уклея, гольян, лещ, чехонь, густера	Мышцы, оболочки глаз, жаберные дужки, лучи плавников	0,21 — 0,38 х 0,14 — 0,24. круглые, овальные	То же	То же	Две круглые, одинакового размера	Движения замедленные	0,17 — 0,24 х 0,11-0,17, задний конец тела расширен
3	Pseudamphistomum truncatum	Плотва, лещ, красноперка, густера, елец и другие карповые	Мышечная ткань	0,32 — 0.46х 0,26 — 0,40, круглые	Две, плотно прилегающие	Овальная, нанимает1/3 тела личинки	Две круглые, одинакового размера (0,08 — 0.01)	То же	0,30 — 0,44 х 0,24 — 0,38, тело покрыто шипиками
4	Clonorchis sinensis	Язь, елец, плотва, красноперка, лещ, сазан, густера, уклея, пескарь, гольян, карась, окунь, толстолобик	Мышечная ткань, подкожная клетчатка	0,150 — 0,1 80 х 0,079 — 0.28, почковидная	Наружная и внутренняя, плотно прилегают друг к другу	Почковидная, занимает 1/3 личинки	Две круглые, брюшная больше ротовой	Подвижная в цисте и освобожденная	0,319 — 0,375 х 0,12 — 0,17, удлиненно-овальная
5	Metagonimus yokogawai	Язь, карась, сиг, лещ, толстолобик, сазан, горчак, пескарь, таймень, ленок	В чешуе и плавниках	0,15 — 0,22, шаровидная пли удлиненно-овальная	Две оболочки	Треугольная с закругленными концами	Две круглые, ротовая вдвое больше брюшной	Слабоподвижная	0,3 — 0,4 х 0,09 — 0,10
6	Nanohietus salmincola	Таймень, ленок, сима, горбуша, кета, хариус, пескарь, елец	Мышцы, почки, жабры, чешуя, мышцы плавников	0,20 — 0,35 х 0,17 — 0,33, овальная	Две, наружная и внутренняя	Овальная	Две круглые, равные	Подвижная в цисте и освобожденная	0,35 — 0,65 х 0,17 — 0,36, удлиненно-овальная
7	Echinochasmus perfoliatus	Щука, линь, сазан, лещ, язь, густера, вобла, красноперка, жерех, белоглазка, карась, судак, ерш	Жаберные лепестки	0,080 — 0,110 х 0,079 — 0,098, овальные, круглые	Наружная оболочка прозрачная, эластичная	Две экскреторные полости овальные	Ротовая присоска с крючьями, брюшная в задней трети тела	Движения очень слабые	0,116 — 0,043, ротовая присоска с адоральным диском и с 24 крючьями
8	Rossicotrema donicum	Окунь, ерш, судак	Плавники, поверхность кожи	0,24 — 0,26 х 1,20 — 0,23, эллипсоидные	Вокруг наружной оболочки черный пигмент кольцами	Из-за пигмента не просматриваются	Не просматриваются	Движения очень слабые	0,49 — 0,53 х 0,13 — 0,15, тело овально-продолговатой формы
	Метацеркарии трематод, непатогенные для теплокровных
9	Paracoegonimus ovatus	Щука, окунь и карповые	В мышечной ткани	,42 — 0,50 с наружной капсулой до 0,70, сферичные темно-прозрачные	Наружная оболочка в 2 — 4 раза толще внутренней	В виде тройника в кольце со щелевидными пространствами, занимает все тело личинки	Две и орган Брандеса 0,08 — 0,12 0,04 — 0,07	Мало подвижные	Яйцевидной формы
10	Bucephalus polymorplius	Судак, реже окунь, щука, карповые рыбы	На жабрах, в плавниках, в мышцах	0,27 — 0,36 х 0,20 — 0,34	Тонкие, неравномерно отлетают друг от друга	Зигзагообразная, занимает 2/3 тела личинки	0,18 — 0,22, имеет пальцевидные мышечные отростки	Движения активные у освобожденных от цист личинок	0,6 — 2,3x0,35, 7 пальцевых выростов
11	Rhipidocotyle illense	Карповые рыбы	На жабрах, плавниках, в мышцах, глазах, мозге, подкожной клетчатке	0,27 — 0,37 прозрачная сферически овальная	Тонкие, неравномерно отлетают друг от друга	Зигзагообразная, занимает 2/3 тела личинки	0,18 — 0,23 х 0,15 — 0,22, имеет два ушкообразных выроста	Движения замедленные у освобожденных личинок	0,8 — 1,0 х 0,16 — 0,28, имеет два усико образных выроста

Для установления видовой принадлежности личинок, особенно из сем. Opisthorchidae, патогенных для человека и животных, нередко прибегают для постановки биопробы. Для этого подопытным животным (котятам, морским свинкам, хомякам) скармливают мясо рыб с метацеркариями трематод или мелкую рыбу. Содержат их в клетках. Вид личинки определяют через 3-4 недели путем обнаружения в фекалиях животных яиц трематод или половозрелых гельминтов в печени, желчном пузыре, кишечнике (в зависимости от вида гельминтов) при вскрытии подопытных животных.