Эксцистирование.
Для изучения строения тела метацеркарии ее извлекают из цисты (эксцистируют). Из крупных цист с непрочной стенкой это удаляется с помощью игл под контролем бинокуляра. Из мелких цист и цист, с прочной гиалиновой оболочкой выделить метацеркарий механически без повреждений удается редко. В этих случаях прибегают к помощи желудочного, кишечного соков или антиформина.
На живых или свежевыделителенных из цист метацеркариях изучают вооружение покровов тела и присосок, шипы адорального диска эхиностоматид, различные придатки вокруг ротовой присоски, железистый аппарат, экскреторную систему. На фиксированном материале многие из этих элементов строения рассмотреть не удается, однако часть эксцистированных экземпляров полезно иметь зафиксированными. Применение витальных красителей, например, нейтрального красного, позволяет выявить некоторые железистые структуры и кишечник.
Рис. 4 - Paragonimus – метацеркарии в цисте
Фиксация
Для сохранения материала и дальнейшего изучения необходимо часть его зафиксировать. Фиксировать следует как эксцистированных метацеркарий, так и их цисты. Наиболее популярным и наиболее доступным фиксатором является 70-градустный этиловый спирт. Спирт приведенной крепости является не только фиксатором, но и средой для длительного хранения материала. В нем можно фиксировать не только метацеркарий, но и кусочки тканей с ними, при этом объем фиксатора должен превышать объем кусочка ткани не менее чем в 20 раза. Поскольку при переносе материала в фиксатор неизбежно заносится и вода, что снижает концентрацию и фиксирующие свойства спирта, то лучше применять спирт крепостью 80.
Существенным недостатком спирта является то, что он слабо фиксирует тканевые и клеточные структуры, деформируя гиалиновые оболочки цист. Для комплексации этого недостатка применяют фиксаторы сложного состава. Наиболее пригодны для этой цели жидкость Корнула, смесь Буэна, фиксатор Ван – Клива.
Окраска
Для приготовления временных и постоянных препаратов метацеркарий окрашивают различными красителями. Для наиболее пригоден уксусно-кислый кармин (УКК). Он не требует предварительной фиксаций, хорошо и стандартно красит живой и свежий материал, хуже красит инцистированные формы. При пользовании УКК нет, опасности перекрасить материал, поскольку последующая дифференцировка уберет избыток краски (но лучше не перекрашивать).
Дифференцировка
Цель этой операции – удаление избытка краски из паренхимы трематоды. Это делает окраску более контрастной и избирательной. Наиболее популярным и почти универсальным реактивом для дифференцировки после окраски является соляно – кислый спирт, т.е. 1%-ный раствор соляной кислоты в 70 – градусном спирте. После окраски УКК хорошим реактивом для дифференцировки является 45%-ный раствор ледяной уксусной кислоты. После дифференцировки кислотой трематод переносят в 70%-градусный спирт.
Рис. 5 - Helicometra
1.6 Обезвоживание
Для приготовления постоянных препаратов, залитых в бальзам или другие аналогичные среды, необходимо тщательно обезвоживание объектов, поскольку бальзам и просветляющие среды не растворимы в воде. Даже следы воды, попавшие в препарат при заливке, делают его непрозрачным.
Обезвоживание ведут в спиртах возрастающей крепости: 70, 80, 90, 96, 100, 100. В каждой из этих спиртов окрашенные метацеркарии выдерживаются по 10-15 минут и только для крупных метацеркарий, таких, как клиностомы и некоторые эхиностоматиды, это время следует увеличить до 20 минут. Если готовится препарат из кусочков ткани, то время пребывания в каждом из спиртов следует увеличить до получаса и более в зависимости от размеров кусочка.
Рис. 6 - Батарея
Наиболее тщательно должно проводиться обезвоживание в заключительной его части. Для этого 100-градусный спирт меняют дважды. Обезвоженные метацеркарии переносятся в просветляющую среду, тщательно оберегая последнюю от попадания в нее влаги.