кровных стекол не должна превышать 0,15—0,17 мм. Более тол­стые стекла резко ухудшают качество получаемого изображения.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ЖИВЫХ КЛЕТОК

Наблюдать микроорганизмы в живом состоянии можно на препаратах: «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток».

Препарат «раздавленная капля»

На предметное стекло наносят маленькую каплю водопровод­ной воды (использовать дистиллированную воду нельзя, так как отсутствие в ней солей может привести к нежелательным измене­ниям клеток микроорганизмов) и переносят в нее небольшое ко­личество культуры изучаемых микроорганизмов, размешивают и покрывают покровным стеклом. Если исследуемые микроорганиз­мы растут на плотной питательной среде, то микробную массу пе­реносят в приготовленную каплю воды с помощью бактериологи­ческой петли. Если же исследуется культура, выращенная в жид­кой среде, то на предметное стекло суспензию клеток наносят с помощью стерильной пипетки. В этом случае каплю воды на пред­метное стекло можно не наносить. Капля с исследуемым материа­лом должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под покровного стекла. Если имеется избыток жидкости, то его

следует удалить фильтровальной бумагой. Приготовленный таким образом препарат помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают его с сухой систе­мой.

Препарат «раздавленная капля» позволяет установить форму клеток изучаемых микроорганизмов, их размеры, расположение, способ спо­рообразования, а также наличие или отсутствие подвижности.

Препарат «висячая капля»

Препарат «висячая капля» ис­пользуют для выявления подвижно­сти у микроорганизмов. Кроме того, в препарате «висячая капля» можно

Глава V

Принципы составления сред для культивирования микроорганизмов. Условия и способы культивирования микроорганизмов

Для накопления, выделения, культивирования и сохранения микроорганизмов пользуются питательными средами, которые не только содержат необходимые питательные вещества, но и явля­ются средой обитания микроорганизмов. Поэтому при составлении сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для их жизни, так и физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут осуществлять обмен между клеткой и средой. Обмен веществ микроорганизмов включает два основных процесса — получение энергии (энергетический обмен) и биосинтез веществ клетки (конструктивный обмен). Конструк­тивный и энергетический процессы не оторваны друг от друга, а представляют собой различные стороны единого обмена ве­ществ. Они протекают в клетке в виде сопряженных химических реакции; часто для конструктивных и энергетических целей ис­пользуется одно и то же вещество.

Элементарный состав живой клетки. В наибольшем количестве в клетках содержатся углерод, азот, водород и кислород. Их назы­вают элементами-органогенами. В значительном количестве в клет­ке обнаруживаются также фосфор и сера и, наконец, в небольшом количестве Fe, Mg, Mn, Си, С1, К, Са, Na, Zn и др., которые назы­вают микроэлементами. Все эти элементы связаны в клетке в раз­личные соединения, 75—85% веществ микробной клетки состав­ляет вода, 15—25%—«сухое вещество». 2—14% сухих веществ приходится на золу, а остальная (большая) часть представлена органическими соединениями.

Чтобы осуществлять биосинтез, расти и размножаться, клетка должна получать извне в необходимых количествах все содержащиеся в ней элементы и должна быть обеспечена источ-

ником энергии. В соответствии с тем, какие именно элементы до­ставляются клетке, вещества питательной среды называют источ­никами углерода, азота, фосфора, серы и т. д. Соединения, в виде которых необходимые для конструктивных целей элементы долж­ны быть внесены в среды, определяются синтетическими способно­стями микроорганизмов. Форма источника энергии — способом ее получения.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы по­лучения ими энергии отличаются чрезвычайным разнообразием. Следовательно, и очень различны их потребности в источниках пи-тания. Это необходимо учитывать при составлении сред, четко представляя, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Таким образом, состав питательных сред определяется прежде всего осо­бенностями, разнообразием обмена веществ микроорганизмов. Так как это разнообразие в подавляющем большинстве случаев про­является в отношении микроорганизмов к источникам углерода и азота, то именно они и определяют специфичность сред. Так на­зываемый «минеральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Среды для одного и того же микроорганизма могут быть раз- ными в зависимости от задач исследования. Например, среды, под­ходящие для длительного поддержания культур микроорганизмов, могут сильно отличаться от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена, когда требуется стимулировать отдельные стороны жизнедеятельности микроорганизмов. Особые среды нужны для образования спор и других покоящихся форм жизненного цикла.

По составу питательные среды подразделяются на две группы: натуральные среды неопределенного состава и ситетические среды.

Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имею­щих сложный неопределенный химический состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные тка­ни, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва, вода морей, озер И минеральных источников. Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. На натуральных средах хорошо раз­вивайся многие микроорганизмы, так как в таких средах имеют­ся, как правило, все компоненты, необходимые для роста и разви­тия. Однако среды с неопределенным составом мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем. что состав нату­ральных сред очень сложен; кроме того, он не является постоян­ным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроор-

57

ганизмов. Натуральные среды неонределенного состава использу­ются главным образом для поддержания культур микроорганиз­мов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

К числу сред неопределенного состава относят и так называе­мые <<полусинтетические» среды. В их состав наряду с сое­динениями известной химической природы входят вещества нео­пределенного состава. Такие среды находят особенно широкое при­менение в промышленной микробиологии для получения аминокис­лот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизне­деятельности микроорганизмов. В качестве примера таких сред можно назвать следующие:

мясо-пептонная среда, в состав которой одновременно с мяс­ным экстрактом и пептоном, имеющим сложный, неопределенный химический состав, входят поваренная соль, фосфорнокислый ка­лий, иногда глюкоза или сахароза;

картофельные среды с глюкозой и пептоном.

В названных средах компонент неопределенного состава яв­ляется основой среды.

Но к полусинтетическим средам относятся и такие, главными составными частями которых являются известные соединения (уг­леводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и т. д.), а компонент неопределенного состава (кукурузный экстракт, дрожжевой авто-лизат, гидролизат казеина) содержится в относительно низких кон­центрациях.

Синтетические среды — это такие среды, в состав ко­торых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить на дистиллированной воде. Для разработки син­тетических сред, обеспечивающих нормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтез какого-либо продук­та его жизнедеятельности, необходимо знание особенностей обме­на веществ данного организма и потребностей его в источниках пи­тания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеет­ся достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средам неизвестного состава. Синтети­ческие среды могут иметь относительно большой набор компонен­тов, но могут быть и довольно простыми по составу (рецепты не­которых синтетических сред приведены в последующем изложе­нии). Синтетические среды наиболее удобны для исследования об­мена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические среды.

Элективные среды были введены в микробиологическую практику С. Н. Виноградским и М. Бейеринком. Эти среды обес­печивают преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодны или совсем не-

пригодны для развития других. Такие среды применяются главным образом дли выделения микроорганизмов из мест их естественно­го обитания, для получения накопительных культур. Понятие «элективные среды» входит в более широкое понятие «элективные условия» (см. «Выделение чистых культур»).

Дифференциально-диагностические среды — это такие среды, которые позволяют по возможности быстро отли-чпть (дифференцировать) одни виды микроорганизмов от других. Их состав подбирается с таким расчетом, чтобы он позволил четко выявить наиболее характерные свойства данного вида. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-инди-каторов, которые окрашивают, например, колонии выявляемых микроорганизмов в определенный цвет. Дифференциально-диагно­стическими средами пользуются в медицинской микробиологии, а также для идентификации и систематики микроорганизмов.

По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических осо­бенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомас­сы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие сре­ды. Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение изолированных колоний), в диагностических целях: описание колоний, установление характера роста на скошенном мясо-пептонном агаре и др., для хранения культур, для количест­венного учета микроорганизмов, определения их антагонистичес­ких свойств и в ряде других случаев. Для уплотнения сред при­меняют агар-агар, желатину и кремнекислый гель. В промышлен­ной микробиологии иногда применяют так называемые сыпучие среды. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, пропитанные питательным раствором, и т. д.

Посуда, предназначенная для приготовления сред и культиви­рования микроорганизмов, не должна содержать посторонних ве­ществ. Лучше всего пользоваться стеклянной посудой. Новую стеклянную посуду моют и погружают на ночь в 1—2%-ный ра­створ соляной или серной кислот, затем тщательно прополаскива­ют и высушивают. Для специальных целей (работа с микроэлемен­тами, витаминами, строго синтетическими средами и др.) иногда требуется особо тщательная очистка посуды. В тех случаях, когда готовят среды не строго определенного состава, можно пользовать­ся эмалированной или алюминиевой посудой.

Не следует готовить впрок больших запасов сред, так как они высыхают, концентрируются и становятся непригодными. Сохра­няют среды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и через них прорастает мицелий плесеней. К каждому со­суду со средой обязательно прикрепляют лист бумаги с обозначе­нием состава (названия) среды и времени ее приготовления.

59