II. Выделение вирусов в куриных эмбрионах

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7 12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования. Живые эмбрионы проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры. Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения могут быть различны: нанесение материала на хорион-аллантоисную оболочку, введение в амниотическую и аллантоисную полости или в желточный мешок. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной РГА на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию «бляшек» на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение вирусов на лабораторных животных

Лабораторные животные используются для выделения вирусов из инф. материала, когда невозможно применить культуры кл. или куриные эмбрионы. Используют преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных в соответствии с цитотропизмом вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на проявлении у животных признаков инфекционного заболевания, их гибели, характере патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглютинации.

Бактериофаги (вирусы бактерий)

Бактериофагами или фагами называют вирусы, поражающие бактерий, которым они всегда сопутствуют. Распространены повсеместно. Взаимодействие бактериофагов с кл. специфично и в зависимости от вида бактерий. Различают бактериофаги кишечной палочки, сальмонелл, клебсиелл, стафилококков. Р-ры от 25 до 200 нм. Геном представлен РНК или ДНК и содержит от 8–9 до 200 генов (соответственно и мелких, и крупных фагов). Существуют в трех формах — внекл. (вирион), размножающейся в кл. (вегетативная форма) и в виде провируса (интегрированной с геномом кл.-хозяина). Большинство бактериофагов по внешнему виду напоминают сперматозоиды. У наиболее сложно устроенных фагов имеется головка кубической симметрии с заключенным в ней геномом и отросток, в котором различают полый стержень, окружающий его чехол, состоящий из актиноподобного, способного к сокращению спирального белка, и находящуюся на дистальном конце стержня базальную пластинку с шипами и нитями (рецепторами), от которых зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине. В пластинке и шипах содержится лизоцим. Есть бактериофаги, устроенные более просто. По морфологии различают 5 типов вирионов бактериофагов: 1-й — нитевидные (в своем составе содержат однонитевую ДНК), 2-й — головка с аналогом отростка (РНК-содержащие и один бактериофаг с однонитевой ДНК), 3 — головка с коротким отростком, 4-й — головка с несокращающимся отростком, 5-й — головка с сокращающимся отростком (3–5 типы, как правило, с двунитевой ДНК). Бактериофаги делятся на вирулентные и умеренные.

Взаимодействие бактериофага с кл.вначале идет адсорбция фага на бактер. кл. Для одних рецепторы бактерий — липопротеины, для других — липополисахариды, тейховые кислоты, Vi-антиген, жгутики бактерий. Нитевидные фаги и фаги с аналогом отростка прикрепляются к F-пилям (секс-пилям).

Второй этап — введение вирусной НК в бактер. кл. У сложных фагов пластинка с шипами прикрепляется к кл.стенке, содержащийся в них лизоцим в месте контакта повреждает кл. стенку, затем внутренний стержень прокалывает стенку клетки и ДНК фага инъецируется в цитоплазму кл. Если бактериофаг вирулентный, то развивается продуктивная инфекция кл. Фаговая НК вызывает перестройку обмена вв инфицир. кл. Репликация бактериофага не отличается от таковой вирусов. Если процесс по каким-либо причинам прерывается, зрелые бактериофаги не образуются, и реализуется абортивный тип инфекции. В случае нормального протекания репродукции образуются зрелые инфекц. фаговые частицы. То есть инфекция продуктивна. Выход образованных фагов из кл.- путем воздействия на кл. стенку бактерий синтезируемым фагом лизоцимом. При этом образуются аутолизины, повышается внутрикл. давление и стенка разрывается (выход путем «взрыва»). Только нитевидные фаги могут проходить через клеточную стенку без ее повреждения. Кол-во образованных в кл.частиц — 100–400 до 20 000 частиц.Если в кл. внедряется умеренный бактериофаг, то после проникновения его ДНК встраивается в геном кл.-хозяина и превращается в профаг. Это явление получило название «лизогения». В этом случае активной репродукции вируса не происходит, а геном фага репродуцируется одновременно с геномом бактерии и передается по наследству дочерним кл.. Такие бактерии называются лизогенными. У них возникает резистентность (им-тет) по отношению к гомологичному вирулентному фагу. Профаг может спонтанно или под действием некоторых индукторов (УФ-облучение, рентгеновское облучение, избыток витамина С, Н₂О₂, повышение t .) начать репродуцироваться (10^2–10^6), т.е. превращается в вирулентную форму.Превращение бактерии из нелизогенной в лизогенную может придавать ей новые св-ва (способность продуцировать экзотоксин). Это явление называется «лизогенная конверсия».

При общей трансдукции в процессе сборки фага внутри кл.в его головку встраивается равный по длине случайный фрагмент ДНК клетки-донора. Такой фаг, проникая в клетку-реципиент, впрыскивает фрагмент ДНК клетки-донора и при рекомбинации генов клетка-реципиент приобретает новые свойства, которые у нее отсутствуют.

Если трансдукция специфическая, то умеренный бактериофаг обязательно встраивается в хромосому кл.-хозяина и при выходе из нее захватывает рядом лежащие ее, но теряет равный захваченному отрезок своей НК. Когда он проникает в клетку-реципиент, то размножаться в ней не может, но привносит в нее строго определенные гены клетки-донора. Донорские гены встраиваются в геном клетки-реципиента и придают ей новые биологические свойства.

Практическое использование бактериофагов:

1. Идентификация бактерий путем постановки пробы фаголизиса. Идентификация проводится видовыми бактериофагами (Vi-I брюшнотифозный, бруцеллезный Т_б, бактериофаги шигелл Зонне, Флекснера и др.) или до биовара (СIV и Эль-Тор II холерные).

2. Фаготипирование с целью определения источника инфекции (Vi-II брюшнотифозные бактериофаги, стафилококковые, сальмонеллезные, склеромные и др., которые лизируют отдельные штаммы данного вида).

3. Определение присутствия в патологическом материале или объектах внешней среды бактерий по наличию соответствующих бактериофагов, что свидетельствует о контаминации этих объектов.

4. Обнаружение бактерий в материале по нарастанию титра бактериофага.

5. Для лечения инф. (дизентерийн., брюшнотифозн бактериофаги) и обширных ожогов с нагноением (колибактериофаг, коли-протейный, стафилококковый, поливалентный клебсиеллезный.).

6. Для проф-ки инфекций (дизентерийный, холерный).

7. Для изучения генетики микроорганизмов.

8. Бактриофаги — сильные стимуляторы Т-клеточного иммунного ответа.