Принцип метода

В результате переаминирования, происходящего под действием АсАТ и АлАТ, образуются соответственно щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты:

СООН СООН СООН СООН

   

СН-NН₂ + С=О  С=О + СН-NН₂

  АсАт  

СН₂ (СН₂)₂ СН₂ (СН₂)₂

   

СООН СООН СООН СООН

аспартат -кетоглутарат оксалоацетат глутамат

СООН СООН СООН СООН

   

СН-NН₂ + С=О  С=О + СН-NН₂

  АлАт  

СН₃ (СН₂)₂ СН₃ (СН₂)₂

 

СООН СООН

аланин -кетоглутарат пируват глутамат

В процессе другой ферментативной реакции (декарбоксилирования) ЩУК превращается в ПВК. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останав-ливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты и определяется с помощью фотоэлектроколориметра.

Ход работы

Определение АсАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора (29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г D,L-аспарагиновой кислоты в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4), добавляют 0,1 мл сыворотки и пробирку помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем прибавляют 0,5 мл динитрофенилгидразинового раствора (19,8 мг 2,4-динитро-фенилгидразина в 100 мл 1 н. раствора НС1) и пробу выдерживают 20 мин при комнатной температуре для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0,4 н NаОН, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0,1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.

Определение АлАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл субстратного раствора для определения АлАТ (29,2 мг -кетоглутаровой кислоты и 1,78 г D,L-аланина в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4), затем добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат на 30 мин при 37° С. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.

Контрольная проба. В контрольную пробу вместо сыворотки крови берут 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности ферментов производят по калибровочному графику, показывающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК с учетом времени инкубации.