Расчеты

Активность фермента рассчитывают по формуле:

где Х-активность пероксидазы, Е*с *кг (Е-единица экстинкции); ∆Е – изменение экстинкции, равное 0,250; t-время реакции, с; d-толщина слоя кюветы, равная 2; 1000-коэффициент перерасчета граммов в килограммы; 0,1-навеска, г; 2-объем пробы, мл.

Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выходе отметить биологическое значение фермента.

Практическое значение работы

Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет пероксидазную активность в отношении практически всех фенолов, ароматических аминов, аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д.

В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении НАД∙Н₂, НАДФ∙Н₂, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д.

В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Переоксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента.

Работа 4. Восстановление цитохрома с.

Цитохромы участвуют в митохондриальной дыхательной цепи в качестве переносчиков электронов от флавопротеидов к кислороду. Кислород активируется и соединяется с ранее ионизированными атомами водорода, образуя воду. При восстановлении красный раствор цитохрома С бледнеет.

Ход работы

В пробирку прилить 0,001% раствор цитохрома С. В другую пробирку с газоотводнойтрубкой налить немного соляной кислоты и бросить кусочек металлического цинка. Закрыть пробирку пробкой с газоотводной трубкой и пропускать пузырьки выделяющегося водорода через раствор цитохрома С. Через некоторое время отметить изменение интенсивности окраски раствора фермента.

Работа 5. Обнаружение активности цитохромоксидазы.

При добавлении к срезам тканей α-нафтола и парафенилендиамина происходит окрашивание тканей вследствие образования индофеноловой сини. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой.

	О2 цитохромоксидаза
α – нафтол n-фенилендиамин		индофеноловая синь

Ход работы

На часовое стекло взять срез свежей ткани, например печени или мышцы, на него нанести по 1 капле 1% спиртового раствора α-нафтола и 1% водного раствора парафенилендиамина. Появление синего окрашивания на срезе ткани указывает на присутствии в ней активной цитохромоксидазы.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – в

1.2. – а

2.1. – 1-в, 2-а, 3-б, 4-г, 5-в

2.2. – 1-г, 2-в, 3-а, 4-б

3.1. – 1,2,3

3.2. – 1, 3

4.1. – D (- + -)

4.2. – С(+ - -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

В результате альдольной конденсации щавелевоуксусной кислоты и меченого по указанным положениям ацетила образуется лимонная кислота со следующим распределением радиоактивной метки

Углеродные атомы, имеющие происхождение из меченого ацетила, в ходе первого оборота цикла окисляться не будут, поэтому радиоактивная метка будет обнаруживаться в центральных атомах регенерированного ЩУК (НООС-¹⁴СН₂¹⁴СО-СООН). В ходе второго оборота, после конденсации ацетила и меченого ЩУК, будет образовываться лимонная кислота:

поэтому, в ходе второго оборота меченые углероды окислительному декарбоксилированию подвергаться не будут и выделится ЩУК со следующим распределением радиоактивной метки НООС-СН₂¹⁴СО-¹⁴СООН. Таким образом, ¹⁴СО₂ будет выделяться в ходе третьего оборота цикла.