Работа 6. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназной активности. Принцип метода

Основан на изменение окраски метиленовой сини при восстановлении его в ходе дегидрогеназной активности. При дегидрировании янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой акцептором водорода является метиленовая синь, которая при восстановлении обесцвечивается. Чем быстрее обесцвечивается метиленовая синь, тем выше активность сукцинатдегидрогеназы. Ингибирование фермента замедляет скорость обесцвечивания метиленовой сини.

Ход работы

В три пронумерованные пробирки поместить 3-4 капли мышечной кашицы и добавить: в первую – 0,8 мл воды, во вторую – 0,2 мл 1% раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, в третью – 0,8 мл 1% раствора малоновой кислоты. Во все три пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора янтарной кислоты и по 1 капле 1% раствора метиленовой сини. После перемешивания добавляют по 3 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37⁰С. Через 5 мин наблюдают изменение окраски раствора. Сравнить степень уменьшения голубого окрашивания в 3-х пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

В основе метода ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо другие пероксидазы).

Конъюгат может быть получен с использованием поликлональных антивидовых антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M, G, А).

В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).

Для проведения анализа используют различные схемы ИФА:

1 – прямой; 2 – конкурентный; 3 – «сэндвич».

1. Прямой ифа

1 – вносят антиген в 0,05 М натрий-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,2) на полистироловый 96-ти луночный планшет (по 50 мкл в лунку), в концентрации 10 мкг/мл;

2 – вносят 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA 10) по 100 мкл в лунку;

3 – вносят исследуемые антитела в буферный раствор с добавлением 0,05%-ного твина (PBSТ) по 50 мкл в лунку;

4 – вносят конъюгат кроличьих антител против IgG мыши конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) по 50 мкл в лунку в буферном растворе PBSТ (рабочее разведение 1 : 1000);

5 – вносят субстрат: раствор ортофенилендиамина (ОФД) – 5 мг на 10 мл 0,05 М цитратного буфера, рН 4,5, с добавлением 5 мкл 30% перекиси водорода, по 100 мкл в лунку;

6 – через 5-30 минут инкубации (после развития желто-коричневой окраски) для остановки реакции вносят 5% серную кислоту по 50 мкл в каждую лунку.

После каждого этапа (за исключением 5) планшеты с соответствующими растворами инкубируют при 37^oС в течение 1 часа. После 2, 3 и 4 этапов планшеты отмывают 6-10 раз холодной водой и трижды раствором PBSТ.

Результаты учитывают на спектрофотометре “Multiskan” при длине волны 492 нм, оптическом пути 3 мм (соответствует 100 мкл раствора в лунке 96-ти луночного планшета).

2. Конкурентный ИФА

В конкурентном ИФА на 3 этапе вместе с конъюгированными с ПХ антителами, вносят исследуемый антиген.

Остальные этапы проводят аналогично – как в непрямом ИФА.

3. «Сэндвич» ИФА

В "сэндвич" ИФА на первом этапе вносят раствор антитела, на третьем этапе – растворы антигенов, на четвертом – конъюгат поликлональных кроличьих антител с ПХ.

Остальные этапы проводят аналогично – как в непрямом ИФА.

Во всех схемах используются следующие условные обозначения:

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – 3

1.2. – 3

2.1. – 1-В; 2-А; 3-Б; 4-Г

2.2. – 1-А; 2-В; 3-Б; 4-Г; 5-Д

3.1. – 2,4

3.2. – 1,2,3

4.1. – Д (- + -)

4.2. – С (+ - -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

График Лайнуивера-Берка – график двойных обратных величин ( против ).

Отрезок на горизонтальной оси = -1/Кm

Отрезок на вертикальной оси = 1/Vmax

Тип ингибирования неконкурентный, т.к. в присутствии ингибитора Кm (т.е. сродство фермента к субстрату ) не изменилась.

Задача 2.

Отрезок на оси абсцисс = Кm (график Михаэлиса-Ментен) или-1/Кm (график Лайнуивера-Берка). Отрезок на оси ординат = Vmax или 1/Vmax соответственно.

В присутствии ингибитора Кm увеличилась (т.е. сродство фермента к субстрату снизилось), а Vmax не изменилась. Следовательно, тип ингибирования конкурентный.

Занятие 10. Коллоквиум по модулю «Ферменты».

Цель занятия. Проверить усвоение студентами учебного материала модуля «Ферменты».

Содержание занятия:

– оценка знания усвоения учебного материала данного модуля каждым студентом с использованием тестового компютерного контроля;

– индивидуальное собеседование преподавателя с каждым студентом по вопросам к коллоквиуму.

Контрольные вопросы к коллоквиуму

1. Что такое фермент? История развития учения о ферментах.

2. Номенклатура и классификация ферментов. Цифровой шифр ферментов. Характеристика отдельных классов и подклассов ферментов. Примеры реакций.

3. Сходства и отличия ферментов и неорганических катализаторов.

4. Общие свойства ферментов. Какие опыты позволяют их обнаружить?

5. Химическая природа ферментов. Простые и сложные ферменты. Что такое кофермент, апофермент, холофермент?

6. Коферменты и их химическая природа. В чем заключается связь между витаминами и ферментами?

7. Активный центр фермента: особенности его строения и роль.

8. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры и рН, графическое изображение зависимости.

9. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности. Основные теории специфичности.

10. Константа Михаэлиса, ее вывод и физический смысл.

11. Зависимость ферментативной реакции от концентрации субстрата. Уравнение Михаэлиса-Ментен. График зависимости. Анализ уравнения Михаэлиса-Ментена (различные соотношения S и К_м). Уравнение Лайнуивера-Берка, его графическое выражение.

12. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента. График зависимости.

13. Активаторы ферментов, типы их действия.

14. Виды ингибиторования ферментов: специфическое и неспецифическое, обратимое и необратимое, конкурентное и неконкурентное. Примеры.

15. Опыт, иллюстрирующий конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы.

16. Механизм действия ферментов с точки зрения изменения энергетики. Влияние ферментов на энергию активации реакции.

17. Механизм действия ферментов с точки зрения событий в активном центре на примере ацетилхолинэстеразы.

18. Единицы выражения активности ферментов.

19. Изоферменты. Значение определения изоферментов в медицинской практике. Изоферменты лактатдегидрогеназы.

20. Понятие о мультиферментных комплексах.

21. Что лежит в основе количественного определения ферментов? Принцип методов количественного определения амилазы и фосфатазы.

22. Медицинская энзимология.

23. Понятие и примеры энзимопатий.

24. Иммобилизованные ферменты (ИФ). Понятие об инженерной энзимологии. Применение ИФ в промышленности.

25. Методы иммуноферментного анализа.