Практическое значение работы

Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментого спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом тканей и органов. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ₃, а в скелетной мышце и печени-ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ₁-31, ЛДГ₂-47, ЛДГ₃-12, ЛДГ₄-5, ЛДГ₅- 4. При инфаркте миокарда увеличивается доля ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ₃ в сыворотке крови.

Работа 4. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по гидролизу n-нитрофенилфосфата.

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты органических эфирных соединений. В зависимости от рН, при котором проявляется их наибольшая ферментативная активность, различают «кислую» и «щелочную» фосфатазы. Термином «щелочная фосфатаза» обозначается целый ряд ферментов с оптимумом активности при рН от 8,6 до 10,1. Сильным активатором этих ферментом является ионы магния.

Щелочная фосфатаза практически содержится во всех тканях человека. Особенно много ее обнаруживается в костной ткани, паренхиме печени, почек, предстательной железы, молочной железы и в клетках слизистой кишечника. Значительная часть фермента поступает из печени с желчью в кишечник.

Принцип метода

Субстрат - п- нитрофенилфосфат натрия гидролизуется ферментом сыворотки с образованием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Ход работы

В опытную и контрольную пробирку вносят по 1 мл субстратно–буферного раствора (рН ~10,0), прогревают при 37⁰С в течении 5 мин. Затем в опытную пробирку добавляют 0,1 мл сыворотки крови, перемешивают и инкубируют обе пробирки в течении 30 мин в термостате при 37⁰С.

После инкубации пробирки охлаждают под струей холодной (!) воды и в контрольную пробу добавляют 0,1 мл сыворотки крови. Затем в обе пробирки интенсивной струей вносят по 10 мл 0,02 н раствора щелочи. Через 5 мин содержимое опытной пробы колориметрируют против контрольной пробы на ФЭКе при длине волны 400-420 нм (синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Расчет: находят разность экстинкций опытной и контрольной проб и по калибровочной кривой получают результаты, выраженные в мкмоль п- нитрофенола, образованного из натриевой соли п-нитрофенилфосфата под действием содержащейся в 0,1 мл сыворотки крови щелочной фосфатазы.

Активность фермента выражают в мкмоль/час на 1 мл сыворотки или в мкмоль-сек. На литр сыворотки крови. Для этого данные, полученные по калибровочному графику, умножают на 20 или 5,57 соответственно.

В норме активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови составляет 1-3 мкмоль/час на 1 мл или 0,278-0,834 мкмоль/сек на литр.

Повышение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови обнаруживается при заболеваниях костной системы (рахит, гиперпаратиреодизм, злокачественные опухоли костей и др.) и печени (механической или обтурационной желтухе, вирусном гепатите, желтой атрофии печени). Уменьшение активности фермента в крови наблюдается при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – б

1.2. – в

2.1. – 1-в, 2-а, 3-б, 4-г

2.2. – 1-б, 2-в, 3-а

3.1. – 1, 3, 4, 5

3.2. – 3, 4

4.1. – А (+ + +)

4.2. – В (+ + -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Ответ. Молярная активность (число оборотов фермента) – количество молекул субстрата, которое превращается в продукт одной молекулой фермента (при полном насыщении субстратом) за единицу времени.

9,6/60:10/50000=800сек^-1

Задача 2.

Ответ. 67210¹¹ г.

Занятие 9. Активаторы и ингибиторы ферментов.

Мультиэнзимные комплексы.

Коферменты – производные витаминов.

Цель занятия. Изучить миханизмы воздействия ингибиторов и активаторов на активность ферментов. Уметь объяснять изменения активности ферментов амилазы и сукцинатдегидрогеназы в их присутствии. Познакомиться с основными принципами иммуноферментного анализа.

Содержание занятия:

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– решение ситуационных задач;

– исследование влияния активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны;

– изучение действия малоната на активность сукцинатдегидрогеназы;

– ознакомление с различными вариантами иммуноферментного анализа;

– участие в выступлении и обсуждении реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Применение ферментов в инженерной энзимологии.

2. Иммуноферментный анализ.