Работа 4. Очистка от низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе (молселекте).

Основным свойством декстранового геля, как хроматографического материала, является способность разделять вещества согласно размерам молекул. Крупные молекулы при хроматографии не проникают в частицы геля и элюируются в свободном объеме, т.е. в свободном пространстве между частицами геля. Применяя сефадексы (молселекты) разных типов с разными размерами частиц и изменяя условия хроматографии, гель-фильтрацию на сефадексах (молселектах) можно использовать для разделения смесей в зависимости от молекулярной массы, для определения чистоты веществ, а также в целях обессоливания и концентрирования растворов высокомолекулярных соединений и др.

Расчеты показывают, что на сефадексе Г-25 (молселекте Г-25) молекулы массой 5600 уже будут элюировать в свободном объеме, а соли и органические вещества с молекулярной массой в пределах 1000 проникают в частицы декстранового геля, обладая коэффициентом распределения 0,7-1,0. Это позволяет сравнительно легко отделить с помощью сефадекса Г-25 (молселекта Г-25) соли и низкомолекулярные органические примеси из растворов белков и других молекул.

Ход работы

Предварительно производят подготовку сефадекса (молселекта) и наполняют колонку. Для этого около 50 г сефадекса Г-25 (молселекта Г-25), достаточного для заполнения 7-8 колонок, необходимо суспендировать в стакане 0,1% растворе хлористого натрия (около 400 мл) и оставить для набухания на двое суток. Затем раствор соли из стакана слить, залить дистиллированной водой, суспензию сефадекса (молселекта) взболтать, дать осесть основной массе геля, а воду с неосевшими частицами слить. Отделение мелких частиц сефадекса повторить 4-5 раз.

Колонку размеров 2x10 см закрепить в штативе в строго вертикальном положении, на дно колонки поместить диск из плексигласа с отверстием и сверху на него опустить кружок фильтровальной бумаги. Колонку на 2/3 объема заполнить водой и в остальную часть постепенно вливать суспензию сефадекса высотой 2-3 см, начать медленно профильтровывать воду, продолжая добавление сефадекса. После образования слоя геля 5-6 см наполнение колонки прекратить, колонку закрыть и над слоем сефадекса поместить кружок фильтровальной бумаги. При наполнении колонки следить, чтобы в колонке не оставалось пузырьков воздуха, и над гелем был слой жидкости.

Для проведения работы открыть подготовленную колонку, дать профильтроваться воде над слоем геля и наслоить пипеткой 1-1,5 мл 2% раствора гемоглобина или другого окрашенного белка с равным объемом 3% раствора хлористого натрия. Как только раствор профильтруется (войдет в гель), ополоснуть стенки колонки небольшим количеством дистиллированной воды и начать элюирование дистиллированной водой со скоростью тока примерно 0,5 мл в минуту. Элюаты объемом 2,5-3 мл собирать в отдельные пробирки. Через 12-15 минут элюирование прекратить, в исходном растворе белка и в отдельных фракциях элюата проверить наличие белка по окраске содержимого пробирок и наличие хлоридов реакцией с азотнокислым серебром (см. выполнение предыдущей работы).

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – а

1.2. – б

2.1. – 1,2 –б; 3,4 – а

2.2. – 1-Г , 2-Б, 3-А, 4-В, 5- Б

3.1.– 4

3.2. – 1,2,3

4.1. – А (+ + +)

4.2. – А (+ + +)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Снизилось процентное содержание альбуминов (в норме альбумины составляют 55,4-78,9%), повысилось содержание α₁- и β-глобулинов. Белковый коэффициент снижен и составляет 0,93. Альбуминов в сыворотке крови больного содержится 30 г/л, глобулинов – 32 г/л.

Задача 2.

Разделение будет более эффективно при рН, равном значению изоэлектрической точки одного из пептидов. В этих условиях этот пептид не будет обладать подвижностью в электрическом поле. Также при выборе рН следует учесть, что пептид с меньшей молекулярной массой будет передвигаться с большей скоростью.

Занятие 5. Сложные белки.

Цель занятия. Изучить и закрепить у студентов знания о структуре и биологической роли сложных белков нуклео-, глико-, хромо-, липо- и фосфопротеинов.

Содержание занятия.

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– решение ситуационных задач;

– проведение лабораторных работ по выявлению гемоглобина, выделению муцина из слюны и выявлению в нем углеводного компонента, выделению казеиногена из молока и выявлению в нем фосфорной кислоты, определению содержания липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови;

– прослушивание и обсуждение реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Строение, биологическая роль металлопротеинов: ферритина, трансферрина и гемосидерина.

2. Особенности строения гликопротеинов клеточной стенки бактерий.