Работа 2. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Принцип метода
Диск-электрофорез (от английского «discontinuous»-прерывистый) представляет собой метод разделения, в котором используется неоднородная («прерывистая») разделяющая система с полиакриламидным гелем в качестве носителя. Полиакриламидный гель представляет собой сополимер акриламидных и бисакриламидных мономеров.
В отличие от электрофореза, где применяется однородная буферная система с постоянным значением pH, при диск-электрофорезе используют пары буферов разного состава и различными значениями pH, а носитель состоит из отдельных слоев геля, отличающихся друг от друга по размерам пор. Благодаря этому разделяемые вещества концентрируются сначала в очень узкой стартовой зоне, что очень важно для четкого разделения смеси.
Разделение белков при этом методе происходит в небольших цилиндрических колонках полиакриламида. В продаже имеются несколько типов приборов для выполнения этого метода.
Например, используется прибор для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле в трубках:
Основные части этого прибора:
1. Стеклянные трубки для геля и подставки для них. Колонки геля готовят в стеклянных трубках, имеющих длину 100 мм и внутренний диаметр 6 см.
2. Прибор для электрофореза, состоящий из верхнего и нижнего резервуаров для буферного раствора. В центре каждого резервуара в цилиндрическом патроне помещается угольный электрод, который вместе с патроном можно извлечь из резервуара. В стенке патрона сделаны отверстия для постоянного контакта электродов с буферным раствором независимо от его уровня. Снизу ко дну верхнего резервуара крепят 12 стеклянных трубок, заполненных гелем. Они размещаются на равном расстоянии от электрода по кругу. Прибор позволяет исследовать одновременно 12 образцов.
Ход работы
Работа состоит из нескольких последовательных операций:
1. Приготовление геля. Стеклянные трубки закрепляют в подставке. В каждую из них пипеткой вносят по 2 мл раствора мономеров и сшивающего вещества для приготовления мелкопористого геля определенных концентраций и сверху наслаивают несколько капель дистиллированной воды. Полимеризация при действии ультрафиолетовых лучей наступает примерно через 30-35 минут.
2. Нанесение сыворотки крови. Сыворотку крови (3-4 мкл) смешивают с 0,15 мл 40% раствора сахарозы и осторожно наслаивают на поверхность каждой колоночки геля.
3. Электрофорез. После внесения пробы трубки заполняют буферным раствором и монтируют ко дну верхнего резервуара. В каждый резервуар заливают по 1 мл соответствующего буферного раствора (pH 8,9). Камеру для электрофореза подключают к источнику постоянного тока (стабилизатор) и включают прибор. Во избежание нагревания геля и изменения физико-химических свойств белков желательно работающий прибор помещать в холодильник. Разделение белков сыворотки крови продолжается 60-120 мин. По окончании электрофореза трубки вынимают из прибора.
4. Извлечение колонок геля и окрашивание белковых фракций. Для извлечения геля из трубок в основном пользуются шприцем с иглой из нержавеющей стали (№ 20 длиной 8 см). Иглу вводят между стеклом и гелем, при нагревании воды осторожными движениями отделяют гель и выталкивают его из трубки. Белковые фракции окрашивают раствором красителя амидового черного. Избыток красителя отмывают несколькими порциями 7% раствора уксусной кислоты.
5. Количественное определение отдельных фракций проводят оптическими методами – прямой денситометрией или денситометрией фотоснимков. При диск-электрофорезе сыворотки в полиакриламидном геле можно получить около 30 отдельных фракций белков.
Для проведения другого вида электрофореза используется прибор для вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в пластине:
Электрофорез белков в пластине полиакриламидного геля имеет ряд преимуществ по сравнению с электрофорезом в трубочках: 1) процесс менее длителен; 2) метод позволяет в абсолютно идентичных условиях проводить одновременное разделение 10 - 13 проб белка; 3) в зависимости от используемого красителя, а также от природы белка на пластине полиакриламида удается обнаружить от 5 до 50 мкг белка.
Ход работы. В пластиковую рамку ячейки-кассеты, представленной на рис. 3. вставляют два стекла. Ячейку герметизируют с помощью специальных прокладок из силиконовой резины. В зазор между стеклами заливают смесь для полимеризации. Если разделение проводят в геле только одного типа, раствор заливают в кассету доверху и сразу же между стеклами вставляют специальную пластинку - так называемую «гребенку». Ее зубцы образуют углубления на поверхности геля, в которые затем вносят образцы белка.
Если в работе используют два типа гелей (концентрирующий и разделяющий), то первоначально в кассету на высоту 85 - 95 мм от дна заливают раствор для полимеризации разделяющего геля. На него осторожно наслаивают дистиллированную воду и кассету оставляют в вертикальном положении до полимеризации геля. После окончания полимеризации воду удаляют фильтровальной бумагой, а на поверхность разделяющего геля наносят смесь для полимеризации концентрирующего геля до полного заполнения кассеты и вставляют гребенку. После окончания полимеризации удаляют одну из герметизирующих прокладок, гребенку вынимают, а ячейку вставляют в прибор. После сборки прибора электродные камеры заполняют буферным раствором, а в лунки на поверхности геля микропипеткой накосят 50 мкл белкового образца приготовленного на 10% растворе сахарозы. После нанесения образца прибор подключают к источнику тока и проводят электрофорез.
После того как маркерный краситель, вносимый с обратом белка. достигнет нижней границы пластины, источник питания выключают. Сливают электродные буферы и вынимают гелевую ячейку. Из ячейки вынимают уплотнительные прокладки, аккуратно отделяют одно стекло от другого и переносят пластину геля в плоскую кювету или пластмассовую коробку. Для фиксации, прокраски и обесцвечивании используют те же растворы, что и в случае цилиндрических гелей.
Время прокраски уменьшают в два раза.
Работа 3. Очистка белков от низкомолекулярных примесей
методом диализа.
Принцип метода
Основан на способности молекул белка (коллоидных частиц) проникать через полупроницаемую мембрану (пергамент, целлофан, колодий и др.), в то время как низкомолекулярные примеси легко проходят через поры этих мембран. Метод диализа широко используется для разделения и очистки белков и других биополимеров от примесей солей и низкомолекулярных органических соединений.
Ход работы
В подготовленный колодиевый или целлофановый мешочек поместить 1 мл сыворотки крови (раствора яичного белка) и 3-4 мл 6% раствора хлористого натрия, аккуратно поместить их в стакан с дистиллированной водой. Через 30-60 минут с небольшими порциями диализируемого раствора белка (содержимое мешочка) и диализата (наружная жидкость) провести пробы на хлориды и белок, чтоб удостовериться в том, что соль диффундировала, а белок остался в мешочке.
Для обнаружения белка провести биуретовую реакцию.
Техника проведения работы. В пробирку добавить 5 капель раствора белка, 10 капель раствора едкого натра и 1 каплю раствора сульфата меди. Отметить появление красно-фиолетового окрашивания.
Для обнаружения хлоридов к 0,5-1 мл раствора добавить 1-2 капли 1% раствора азотной кислоты и 1-2 капли 1% раствора азотнокислого серебра и отметить выпадение творожистого осадка.