Работа 2. Количественное определение свободного оксипролина в моче.

Количество оксипролина в моче преимущественно зависит от распада коллагена в тканях. У взрослого человека с мочой за сутки выводится до 8 мг свободного оксипролина. Экскреция оксипролина возрастает при деструктивных процессах в соединительной ткани.

Оксипролин с реактивом Эрлиха образует продукт розового окрашивания.

Ход работы

В две робирки (контроль и опыт) отмерить по 1 мл профильтрованной мочи, добавитьпо 1 мл 0,01М раствора сернокислой меди, по 1мл 2,5М раствора NaOH и по 1 мл 6% раствора пергидроля. После перемешивания обе пробирки поместить на 10 мин. в водяную баню при 70⁰С и периодически помешивать. Пробы охладить в воде со льдом (снегом), добавить в каждую пробирку по 4 мл 3 н раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха (5% раствор п – диметил амнобензальдгида в пропаноле или изопропаноле). Контроль оставить в воде со льдом, опыт нагреть до 100⁰ С и кипятить в течение 80 сек. В опытной пробирке развивается розовое окрашивание.

Содержимое обеих пробирок колориметрировать на ФЭКе в кюветах на 10 мм. Из экстинкции опыта вычесть экстинкцию контроля и по калибровочному графику найти содержание оксипролина в 1 мл мочи. Вычислите количество оксипролина в 100 мл или суточном количестве мочи.

Работа 3. Определение холинэстеразы в головном мозге.

В тканях мозга содержатся специфическая и неспецифическая холинэстеразы. Специфическая – гидролизует ацетилхолин, неспецифическая – гидролизует, помимо ацетилхолина, также бутирил- и бензоилхолины.

Взвесить на торсионных весах 100-200 мг ткани серого вещества больших полушарий или коры мозжечка (ферментативная активность мозга сохраняется на холоде в течение 1-2 недель). Навеску ткани растереть в ступке в 50-кратном количестве дисстилированной воды до образования равномерной опалесцирующей взвеси. Осевшую часть из раствора перенести в 2 пробирки, добавить по 3мл дистиллированной воды. В первую (контроль) добавить 1 мл индикаторно-буферного раствора №1 (200 мг бромтимолового синего ратереть в ступке с 20 мл 0,1Н раствора NaOH). Раствор перенести из ступки в мерную колбу (на 1 л), добавить 50мл 0,1М раствора (борной кислоты) в 0,1 М растворе KCl. Содержимое колбы довести до метки свежей дистиллированной водой. Раствор имеет насыщенно синий цвет и рН 8,4, стоек при хранении. Во вторую пробирку (опыт) добавить 1 мл индикаторно-буферного раствора №2 (1,8 мл индикаторно-буферного раствора №1 сливают с 0,2 мл 1% раствора ацетилхолина или 0,2 мл 1,57% раствора бутирилхолинйодида, или 1,1% раствора бутирилхолинйодида; готовить раствор следует не раньше, чем за 3 часа до опыта).

Обе пробирки поставить в термостат при температуре 38⁰ С на 15 мин. при необходимости дольше. В результате ферментативного расщепления субстрата наблюдается постепенное освобождение уксусной и масляной кислоты и изменение окраски индикатора в опытной пробирке от синего или сине-зеленого к желтому цвету.

Работа 4. Выделение гликогена из мышечной ткани.

При экстракции используется способость гликогена к растворению в кислой среде. Применение трихлоруксусной или хлорной кислот в качестве экстрагирующего агента одновременно дает возможность освобождения раствора от примесей белков, нуклеиновых кислот и других полимерных соединений. Гликоген, подобно белкам, обладает резко выраженными гидрофильными свойствами, поэтому его можно легко осадить из раствора при высаливании солями щелочных и щелочно-земельных металлов, солями тяжелых металлов,спиртом.