Ход определения

В две пробирки (одна для определения общего, а другая — свободного сульфадимезина) отмеривают по 1 мл разведенной в 20 раз мочи, по 1,5 мл дистиллированной воды и по 0,25 мл раствора соляной кислоты. В третью пробирку (контрольную) вносят 2,5 мл воды и 0,25 мл раствора соляной кислоты.

Одну пробирку (для определения общего сульфадимезина) закрывают пробкой, обернутой фольгой, и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирку охлаждают.

Во все три пробирки приливают по 2 капли раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают содержимое и оставляют стоять 10 мин. Добавляют во все пробы по 1,5 мл насыщенного раствора ацетата натрия, закрывают пробирки пробками и энергично встряхивают их несколько раз.

Прибавляют во все пробирки по 0,25 мл раствора ацетилированной Н-кислоты. Вновь перемешивают содержимое и оставляют стоять пробы на 15 мин для развития окрашивания.

Измеряют экстинкцию опытных проб против контроля на ФЭКе при 440 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет проводят по формуле:

(Е₂ – Е₁)100

Х = ------------------ ,

Е₂

где х – ацетилирующая способность организма, % ацетилированного сульфадимезина; Е₁ – экстинкция свободного сульфадимезина, содержащего в пробе, не подвергавшейся гидролизу; Е₂ – экстинкция общего сульфадимезина (свободный + ацетилированный), содержащийся в пробе, подвергнутый гидролизу.

Занести значения экстинкции в тетрадь и рассчитать ацетилирующую способность организма по сульфадимезину. Сделать вывод о возможности метаболизма ксенобиотиков посредством ацетилирования и значении этого процесса.

По степени ацетилирования сульфаниламидов или других ксенобиотиков, подвергающихся в организме ацетилированию, судят об активности ферментной системы ариламинацетилтрансферазы в клетках, которая катализирует реакции ацетилирования (конъюгации) различных соединений. Для сульфаниламидов реакция ацетилирования является основным ведущим механизмом конъюгации, другие конъюганты для большинства сульфаниламидов образуются в незначительном количестве. Ацетилирование приводит к инактивации (обезвреживанию) сульфаниламидов и выведению их из организма с мочой. Поэтому степень ацетилирования сульфаниламидов указывает также на соотношение бактериостатически активной и неактивной форм препаратов. Чем быстрее ацетилируется сульфаниламид, тем меньше его бактериостатическая активность.

Работа 2. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида

изоникотиновой кислоты (ГИНК) в организме.

Принцип метода

Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричнево-красного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза указывает на степень ацетилированпя ГИНК в организме:

Ход определения

Собранную мочу разводят в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки вносят по 1 мл разведенной мочи; в одну из них (для определения общей ГИНК, т. е. суммы свободной и ацетилированной форм препарата) добавляют 1 мл раствора соляной кислоты, а во вторую (для выявления свободной ГИНК) — 1 мл дистиллированной воды.

Первую пробирку закрывают пробкой и ставят на 20 мин на кипящую водяную баню, после чего охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки приливают по 2 мл реактива метаванадата аммония и отмечают разницу в окрашивании исследуемых проб мочи.

Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется специальной ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. В зависимости от активности этого фермента у разных людей их делят на быстрых и медленных «инактиваторов» (ацетиляторов) ГИНК, что имеет значение не только для практической фармакогенетики, но и для рациональной терапии. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата для конкретного больного.