Nad(p)h fmn убихинон cyt b cyt c1 cyt c cyt aa3 o2
Железосерные белки выполняют роль посредников (накопителей электронов) при контакте FMN с убихиноном и цитохрома b с цитохро-мом с1. В железосерных белках и в цитохромах перенос электронов осу-ществляется за счёт окисления и восстановления атомов железа Fe2+ и Fe3+.
Убихинон (кофермент Q) переносит электроны за счёт превращения его в гидрохинон:
Понятно, что с помощью убихинона идёт не только транспорт элект-ронов, но и перенос протонов, которые при образовании аниона гидрохи-ноновой формы могут быть приняты в матриксе, а при окислении с об-разованием хиноновой формы они могут быть отданы уже в межмембран-ное пространство. У гидрохинонов есть три степени окисления: сами гид-рохиноны, свободнорадикальные семихиноны (-е) и хиноны (-2е), все они включены в систему перекачки протонов против градиента концентрации.
Перенос протонов возможен также в результате окислительно-восстановительных превращений гемов, так как в максимальной степени окисления атом железа связан с одним анионным остатком, а при переходе железа в двухвалентное состояние этот анион может быть протонирован.
Очень важна роль цитохромов а и а3, связанных в прочный комплекс. Эти переносчики электронов имеют две гемовых компоненты и два иона меди, которые также участвуют в переносе электронов за счёт перехода
Важность согласованной работы комплекса цитохромов а и а3 состоит в том, что они должны одновременно перенести на молекулу кислорода четыре электрона. Любой сбой в этой системе вызовет образование актив-ного окислителя – супероксида (один электрон), пероксида (два электрона) или гидроксильного радикала (три электрона).
В соответствии со старыми представлениями о работе системы окис-лительного фосфорилирования предполагалось, что перенос электронов от NAD(Р)H сопровождается переносом из матрикса в межмембранное пространство шести протонов, в результате чего в нём устанавливается кислая среда с рН около 4,0. Возникший градиент концентраций протонов при обратной диффузии их через АТФ-синтетазный комплекс белков при-водит к фосфорилированию АДФ активным фосфатом (в схеме А и R означают, соответственно, адениновый и рибозидный остатки):
Сегодня считается, что интегрированные в мембрану пигменты элект-ронпереносящей цепи скомпонованы в четыре комплекса. В состав перво-го входит NAD, второй включает FAD, третий включает цитохромы b и с1, четвёртый – цитохромы а и а3. Цитохром с – это периферический гемо-протеин с небольшой молекулярной массой (в его составе кроме гема около ста аминокислот), он растворим в воде и легко перемещается по внешней стороне внутренней мембраны, осуществляя связь между раз-ными комплексами электронпереносящей цепи.
Установлено, что для синтеза одной молекулы АТФ из межмебран-ного пространства в матрикс входят три протона, но для этого из матрикса должны выйти четыре протона, так как один протон теряется при обмене молекулы АТФ, образовавшейся в матриксе, на поступающие из меж-мембранного пространства АДФ и фосфат. Работа электронпереносящей цепи, сопровождающая окисление восстановительного потенциала одной молекулы NAD(P)H, завершается выходом из матрикса в межмембранное пространство десяти протонов. Окисление молекулы FADH2 с более низ-ким восстановительным потенциалом сопровождается выходом шести протонов. Из них, очевидно, два протона – это результат образования в матриксе недиссоциирующей молекулы воды из молекулы кислорода (свя-зывание двух протонов в матриксе эквивалентно появлению двух протонов в межмембранном пространстве), а ещё восемь (или четыре от FADH2) – это не установленная во всех деталях работа убихинона и других пигмен-тов электронпереносящей цепи. В соответствии с этим окисление одного моля NAD(P)H завершается образованием 2,5 молей АТФ, а окисление одного моля FADH2 даёт 1,5 моля АТФ.
Внутренняя (обращенная к матриксу) поверхность крист внутренней мембраны плотно покрыта сферическими белковыми структурами, кото-рые прикреплены к интегрированному в мембрану комплексу нескольких белков. Вместе они образуют ферментную систему АТФ-синтетазы (иног-да её называют также АТФ-синтазой), осуществляющей биосинтез АТФ из АДФ и фосфата. В ходе эволюции этот фермент изменялся очень незна-чительно. Во всяком случае различия между АТФ-синтетазами прокариот, одноклеточных организмов, хлоропластов в растениях, митохондрий в клетках растений и животных очень незначительны. Принцип функциони-рования АТФ-синтетаз лежит также в основе биохимических систем, при-водящих в движение жгутики однолеточных и сперматозоидов.
Долгое время не удавалось установить механизм работы АТФ-синте-тазы. Было известно, что она состоит из двух принципиально различных комплексов белков. Один из них с обозначением Fo (он блокируется олиго-мицином) интегрирован в мембрану, другой (F1) связан с первым, но выступает из мембраны. Их можно разделить поместив мембрану с АТФ-синтетазой в солевой раствор, отделяющий растворимую в воде компо-ненту F1 от мембраны. Современные достижения в исследовании про-странственного строения белков, позволили получить достаточно точное представление о функционировании этой системы, похожей на электро-мотор из белковых молекул.
Интегрированная в мембрану компонента Fо состоит из трех различ-ных типов гидрофобных белковых субъединиц. Субъединица а передает усилие от на субъединицу b и одновременно она представляет собой часть механизма, преобразующего энергию движущихся протонов во вращатель-ное движение. Субъединица b связывает с мембраной компоненту F1 и также передает услилие. Она, как и субъединица а, состоит из двух пептидных цепей. У бактерии Escherichia Coli субъединица с представлена двенадцатью белковыми цепями, каждая из которых сложена вместе с образованием петли примерно в середине цепи. Внутренняя часть кольца, составленного субъединицами с, покрыта фосфолипидами, которые закры-вают проход протонам. Каждая пептидная цепь субъединицы с включает актиный центр, который создает механическое напряжение при отходе от него протона. Присоединение к этому центру протона вызывает поворот цепи в исходное состояние. Этот поворот создает усилие на субъединице а.
Растворимая в воде компонента F1 находится на обращенной к матри-це стороне внутренней мембраны митохондрии. В её состав входят пять субъединиц от α до ε. Три пары белков, обозначаемых буквами и , образуют три комплекса, на которых идёт синтез АТФ из АДФ и фосфата. Субъединица γ представляет собой вращающуюся ось АТФ-синтетазы. Её вращение, вызванное движением протонов в компоненте Fо, вызывает структурную перестройку в субъединицах и . Субъединица δ соединяет комплекс трех пар белков и с интегрированной в мембрану субъедини-цей b, и не даёт им вращаться вместе с осью γ. Предполагается, что субъединица ε связывает с осью γ кольцо из субъединиц с. На рисунке представлено схематическое изображение АТФ-синтетазы из бактерии Escherichia Coli:
Активные центры, отвечающие за биосинтез АТФ, расположены меж-ду белками и . Структурной перестройкой образующих активный центр аминокислотных фрагментов этих пар белков управляет ротор . В одном фиксированном положении активный центр, образованный первой парой белков и , открыт, и в него входят и соответственно ориентируются молекулы АДФ и фосфорной кислоты. В другой паре и создаются условия для фосфорилирования АДФ фосфорной кислотой и образуется АТФ (по приведённой на с. 164 реакции активации фосфорной кислоты с образованием фосфорцентрированного катиона). В третьей паре активный центр раскрыт и образовавшаяся молекула АТФ покидает его. В результате диффузии трёх протонов через субъединицу Fо ротор и связанный с ним белок поворачиваются на 120 и вызывают структурную перестройку в создающих активный центр белках и , в результате которой в первой паре создаются условия для синтеза АТФ, вторая пара открывает активный центр и освобождается от образовавшей молекулы АТФ, а третья пара принимает АДФ и фосфат. В следующем повороте на 120 роли снова поменяются в этом порядке. Поскольку в состав комплекса F1 входят три пары катализирующих биосинтез АТФ белков и , один полный оборот ротора с белком в самом благоприятном случае приводит к образова-нию трёх молекул АТФ. Работа этой системы носит обратимый характер. В избытке АТФ ротор вращается, вызывая транспорт протонов против градиента концентраций (АТФ при этом гидролизуется на АДФ и фосфат). Этот процесс используется некоторыми бактериями для поддержания водно-солевого баланса.
В АТФ-синтетазе природой реализован не имеющий аналогов в органической химии механизм использования энтропийного фактора для образования источника свободной химической энергии.
Для раскрытия деталей этого механизма было использовано много оригинальных методик, включая, например, присоединение к выступаю-щему из F1 субъединицы концу ротора фибриллярного белка актина с молекулами светящегося в УФ-свете люминофора, присоединёнными к функциональным группам на поверхности этого фибриллярного белка. С помощью микроскопа можно наблюдать его вращение и даже определять скорость вращения. Весь этот комплекс исследований был отмечен Нобелевской премией 1998 года.