1.3. Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых

Определение концентрации белка проводят в научных учреждениях при изучении, выделении и очистке белков; в промышленности в процессе получения ферментов, пищевых белков, белковых лекарственных препаратов; в медицинских биохимических лабораториях для оценки состояния печени и почек.

Существует много разных методов количественного определения белков. Среди них широкое распространение получили колориметрические методы, основанные на способности белков давать окрашенные комплексы с рядом реактивов (цветные реакции). Среди этих методов наиболее распространены биуретовый метод и его модификация (метод Лоури¹).

Цель работы

Освоить работу фотоэлектроколориметра (ФЭК). Научиться строить стандартные калибровочные кривые. Определить содержание белка в пробе с неизвестной концентрацией.

Принцип метода

Биуретовый метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде (биуретовая реакция). Интенсивность развивающейся окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка и определяется фотометрически. Для количественного определения белка измеряют интенсивность окраски стандартных растворов белка с известной концентрацией (величину оптической плотности Dст). По полученным данным строят график зависимости оптической плотности окрашенных растворов от концентрации в них белка (стандартную калибровочную кривую). На оси ординат всегда откладывают величину D как функцию от задаваемых значений (см. рисунок).

Измеряют оптическую плотность Dх окрашенного раствора с неизвестной концентрацией белка и по стандартной кривой определяют в нем концентрацию белка. В качестве стандартного белка обычно используют раствор сывороточного альбумина.

Выполнение работы

Реактивы, мл	Контроль	Стандартный белок 10 мг/мл		Стандартный белок 20 мг/мл		Стандартный белок 30 мг/мл	Неизвестный белок Х мг/мл
Раствор сывороточного альбумина, мл	—	0,2		0,2		0,2	0,2
Н2О, мл	0,2	—		—		—	—
Биуретовый реактив*, мл	5	5		5		5	5
Перемешивают и инкубируют 30 минут при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О ( = 545 нм, толщина кюветы 1 см). D545
Dст – Dк; Dх – Dк

*Биуретовый реактив: исходный концентрат (медь сернокислая – 120 ммоль/л, калий иодистый – 300 ммоль/л, калий-натрий виннокислый – 320 ммоль/л, гидроксид натрия –3 моль/л) разводят перед работой 1:19

Оформление работы

В рабочей тетради записать и заполнить таблицу; построить стандартную кривую и определить по ней концентрацию белка в неизвестном растворе.

Выводы

Т естовые задания по теме: «Аминокислоты и простые белки»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1. Имидазольное кольцо гистидина содержит 1 атом азота.

2. N-концевая аминокислота в дипептиде гистидиллизин - гистидин.

3. С-концевая аминокислота в трипептиде серилпролилглицин - глицин.

4. Альбумины сыворотки крови выполняют транспортную функцию.

5. Пролин содержит имино-группу.

6. Аспарагиновая кислота является производным янтарной кислоты.

7. Все ли пептиды дают положительную биуретовую реакцию?

8. Зависит ли интенсивность окраски вещества в растворе от его концентрации?

9. Можно ли разделить белки методом высаливания, используя сернокислую медь (сульфат меди)?

10. Встречаются ли в организме человека аминокислоты, которые не входят в состав белков?

11. Участвует ли ε-NH₂-группа лизина в образовании пептидной связи в белках?

12. Обладают ли радикалы серина и валина гидрофильными свойствами?

2) Выбрать один правильный ответ

Аминокислота с незаряженным радикалом: треонин лизин аргинин гистидин глутаминовая кислота

Для определения оптической плотности синего раствора используют светофильтр: голубой желтый красный зеленый синий

3) Найти соответствие

АМК	Химическая группа в составе радикалов
метионин серин аргинин цистеин аспарагин	А. гидроксильная Б. амидная В. тиометильная Г. гуанидиловая Д. сульфгидрильная