4.3.3. За допомогою середовищ певного хімічного складу можна ідентифікувати специфічні чинники зростання [21]

До початку 70-х років культивування тканини було щось на зразок суміші науками і чаклунствами. Хоча на зміну згусткам плазми прийшли пластмасові чашки і рідкі середовища з точно складеною сумішшю солей, амінокислот і вітамінів, все ж в більшості середовищ містилася невелика кількість погано охарактеризованого біологічного матеріалу, наприклад кінська сироватка, очищений екстракт з курячих ембріонів або ембріональна сироватка корови Для більшості звичайних тканинних культур такі середовища використовуються досі (таблиця. 4-4), але вони не придатні для вивчення особливих потреб, що виникають в процесі зростання і диференціювання клітин.

Усе це привело до того, що були розроблені спеціальні середовища певного хімічного складу, використовувані для культивування клітин різних типів. У цих середовищах відомий кожен з компонентів. Разом з низькомолекулярними речовинами вони, як правило, містять один або декілька різних білкових чинників зростання, необхідних клітинам для виживання і проліферації в культурі, : наприклад, деяким нервовим клітинам як в культурі, так і в

5. Основні генетичні механізми

Здатність клітин підтримувати високу впорядкованість своєї організації в хаотичному Всесвіті залежить від генетичної інформації, яка реалізується, зберігається, відтворюється, а іноді і удосконалюється в чотирьох генетичних процесах - синтезі РНК і білка, репарації ДНК, реплікації ДНК і генетичної рекомбінації. Ці процеси, в яких створюються і підтримуються клітинні білки і нуклеїнові кислоти, одновимірні: в кожному з них інформація, що знаходиться в лінійній послідовності нуклеотидів, використовується для освіти або для зміни іншої лінійної послідовності нуклеотидів (молекули ДНК або РНК) або лінійної послідовності амінокислот (молекули білку). Тому генетичні події простіше для розуміння, ніж більшість інших клітинних процесів, пов'язаних з вираженням інформації, яку несуть в собі складні тривимірні поверхні білкових молекул. Можливо, саме завдяки цій відносній простоті генетичних механізмів ми знаємо і розуміємо їх набагато краще, ніж велику частину інших подій, що відбуваються в клітині.У цій главі ми розглянемо молекулярні механізми, що забезпечують репарацію, реплікацію і зміну клітинної ДНК. Ми побачимо, що ці механізми залежать від ферментів, що розщеплюють, копіюють і рекомбінують нуклеотидные послідовності Ми покажемо далі, що віруси, плазмиды і мобільні генетичні елементи поводяться відносно цих і інших ферментів як паразити, не лише використовуючи їх для власної реплікації, але і змінюючи - за допомогою генетичної рекомбінації - клітинний геном. Завершальна частина глави присвячена тому, як знання основних генетичних механізмів реалізується практично в методиках виділення генів і генних продуктів.Спершу, проте, ми знову повернемося до центральної теми, вже зачепленої коротко в гл. 3, а саме до механізмів синтезу РНК і білка.

ЛЕКЦІЯ 10 5.1. Синтез РНК і білка

На долю білків доводиться зазвичай більше половини сухої маси клітини і синтез їх грає головну роль в таких процесах, як зростання і диференціювання клітин, підтримка їх структури і функції. Синтез білку залежить від спільної дії декількох класів молекул РНК і йому передує ряд підготовчих етапів Спочатку в результаті копіювання ДНК, що несе інформацію про білок, що синтезується, утворюється молекула матричною РНК (мРНК). Одночасно в цитоплазмі клітини до кожної з 20 амінокислот, з яких будується білок, приєднується молекула специфічною транспортною РНК (мРНК), а до субодиниць рибосоми, на якій відбувається синтез, приєднуються деякі допоміжні білкові чинники. Початком синтезу білку вважається той момент, коли ці компоненти об'єднуютьсяу цитоплазмі, утворюючи функціональну рибосому. У міру того як молекула мРНК крок за кроком просувається крізь рибосому, її нуклеотидная послідовність переводиться (транслюється) у відповідну послідовність амінокислот, внаслідок чого створюється певний білковий ланцюг Проте передусім необхідно відповісти на питання про те, як утворюються в клітині різні молекули РНК.. Фермент починає синтез у спеціального старт-сигнала в ДНК званого промотором, і закінчує його у стоп-сигналу (сигнал терминации транскрипції), після чого полимераза і синтезований готовий ланцюг РНК відділяються один від одного. Швидкість полімеризації при 37°Із складає приблизно 30 нуклеотидів в 1 з, тому синтез ланцюга РНК завдовжки 5000нуклеотидів триває близько 3 мін

синтезу білку, а також транспортні, рибосомні і інші види молекул РНК, виконуючі структурні і каталітичні функції. Синтез цих молекул РНК, т. е. синтез РНК-копий нуклеотидных послідовностей тих або інших ділянок молекули ДНК каталізується ферментами, які називаються РНК-полимеразами. У эукариот різні види РНК синтезуються різними РНК-полимеразами, тоді як у прокариот увесь синтез РНК здійснюється одним-єдиним ферментом цього типу. Майже усе. що ми знаємо про РНК-полимерах, було з'ясовано на бактеріях.Бактерійна РНК-полимераза - це великий, такий, що складається з декількох субодиниць фермент, пов'язаний з рядом допоміжних білкових субодиниць, які на різних етапах транскрипції приєднуються до комплексу ПОЛИМЕРАЗА-ДНК, а потім покидають його (см разд. 9 4 1) Вільні молекули РНК-полимеразы, стикаючись з хромосомою випадковим чином, приєднуються до більшості ділянок ДНК дуже неміцно. Проте цей зв'язок виявляється дуже міцним, якщо РНК-полимераза приєднується до специфічної послідовності ДНК. до так званого промотора, що містить старт-сигнал для синтезу РНК тік сайту з якого цей синтез повинен початися. Реакції, які за цим йдуть, показані на мал. 5.1. Приєднавшись до промотора, РНК-полимераза розкручує певну ділянку подвійної спіралі, оголяючи гаким чином нуклеотиди на короткому відрізку кожної з двох ланцюгів ДНК. Один з цих двох розділених ланцюгів повинен тепер служити матрицею РНК-полимераза, що переміщається уздовж спіралі ДНК, безперервно розкручує спіраль попереду тієї точки, де відбувається полімеризація, і знову закручує її позаду цієї точки, вивільняючи новосинтезований ланцюг РНК. Тому невелика ділянка РНК-ДНК-спіралі (для бактерійного ферменту - близько 17 пар нуклеотидів) існує лише короткий час. Готовий РНК-продукт вивільняється в виді одноланцюговою копії однієї з двох ланцюгів ДНК. Спаровування комплементу підстав ДНК з підставами мономерів, що поступають, - рибонуклеозидтрифосфатов; полимераза сполучає між собою два перші мономери, що поступають, і тим самим кладе початок ланцюга, що синтезується, РНК. Потім РНК-полимераза, просуваючись niai за кроком уздовж ДНК, розкручує перед собою спіраль ДНК, оголяючи всякий раз нову ділянку матриці для спаровування комплементу підстав. Таким шляхом, додаючи до зростаючого ланцюга РНК по одному нуклеотиду, вона поступово нарощує цей ланцюг у напрямі 5' -> 3' (мал. 5-2). Процес подовження ланцюга РНК триває до тих пір, поки фермент не зустріне на своєму шляху ще одну специфічну нуклеотидную послідовність в ланцюзі ДНК, а саме сигнал терминации транскрипції (стоп-сигнал). Досягнувши цієї точки, полимераза відділяється і від матричної ДНК, і від новосинтезованого ланцюга РНК (см також мал. 5-6, 6). Під час просування ферменту уздовж матричного ланцюга в його активному центрі утворюється подвійна спіраль РНК-ДНК. Вона дуже коротка, оскільки позаду молекули полимеразы негайно відновлюється спіраль ДНК-ДНК, а РНК витісняється (мал. 5-3). Тому кожен завершений ланцюг РНК відділяється від ДНК-матриці у вигляді вільної одноцепочечной молекули, в якій число нуклеотидів коливається зазвичай від 70 до 10000.

5.1.2. Промоторна послідовність визначає, який саме ланцюг ДНК транскрибуватиметься [2]. В принципі будь-яка ділянка ДНК може бути транскрибована з утворенням двох різних молекул мРНК - по одному на кожного з двох ланцюгів подвійної спіралі ДНК. Насправді ж в будь-якій ділянці ДНК транскрибується тільки один з двох ланцюгів, оскільки що утворилася РНК відповідає по своїй нуклеотидной послідовності інший, нематричному ланцюгу ДНК. Який з двох ланцюгів транскрибуватиметься, визначається промотором, нуклеотидная послідовність якого орієнтована так, щоб направити РНК-полимеразу на той або інший шлях. Оскільки ланцюги РНК ростуть лише у напрямі 5 > 3. саме від промотора залежить вибір ланцюга ДНК для транскрипції (мал. 5-4). У двох сусідніх генів нерідко транскрибуються різні ланцюги ДНК, як це можна бачити на мал. 5-5, де зображена невелика ділянка хромосоми. каталізує синтез усіх РНК, кодуючих білок (тобто мРНК), тоді як дві інші синтезують молекули РНК виконуючими структурними або каталітичними функціями (наприклад, рибосомні і транспортні РНК) Усі три РНК-полимеразы є великі мультимерные молекули, що нагадують бактерійний фермент, але промотори, які вони дізнаються, складніше по своїй будові і поки що не так добре вивчені (см разд 9 4.3). Неясно, чому такі складні молекули і бактерійної РНК-полимеразы. і РНК-полимеразы эукариот. Ці молекули складаються з декількох субодиниць із загальною масою понад 500 ТОВ дальтон. Між тим відомо, що РНК-полимеразы деяких бактеріофагів, що складаються з одного ланцюга і мають уп'ятеро меншу масу, каталізують синтез РНК не менш ефективно, чим відповідний фермент клітини-хазяїна. Можна припустити, що мультимерное будова клітинних РНК-полимераз має якесь відношення до регуляторних аспектів клітинного синтезу РНК, поки що недостатньо добре з'ясованим.У приведеному вище описі транскрипції ДНК опущено багато подробиць: зазвичай синтез молекули мРНК включає і ряд інших складних етапів. Відомо, наприклад, що у визначенні гого, які ділянки ДНК транскрибуватимуться РНК-полимеразой, важливу роль грають особливі білки, регулюючі активність генів, а значить, саме від них в першу чергу і залежить, які білки вироблятиме клітина. Далі, тоді як у прокариот молекули мРНК утворюються безпосередньо шляхом транскрипції ДНК, в клітинах вищих эукариот більшість РНК-транскриптов, перш ніж покинути клітинне ядро і перейти в цитоплазм) у вигляді мРНК, зазнають істотні зміни - піддається сплайсингу. Усі ці аспекти процесу утворення мРНК ми обговоримо в гл. 9 і 10. де мова піде про клітинне ядро і про регуляцію експресії генів. Тут же ми просто виходитимемо з того, що в клітині так чи інакше утворюються функціональні молекули мРНК, і познайомимося з тим, як вони направляють білковий синтез.

5.1.3. Молекули транспортних РНК служать адаптерами, що переводять нуклеотидные послідовності в амінокислотні [3]

У усіх клітинах є набір транспортних РНК (тРНК) - невеликих молекул, розміри яких коливаються від 70 до 90 нуклеотидів. Ці РНК, приєднуючись одним своїм кінцем до специфічного кодон) мРНК, а іншим приєднуючи амінокислоту, що кодується цим триплетом, дозволяють амінокислотам вишиковуватися в порядку, що диктується нуклеотидной послідовністю мРНК. Кожна тРНК може переносити тільки одну з 20 амінокислот, використовуваних в синтезі білку. Транспортну РНК, переносячу гліцин, означають тРНКс1у і т. д. Для кожної з 20 амінокислот є щонайменше один тип гРНК, для більшої ж частини амінокислот їх є декілька. Перш ніж включитися в білковий ланцюг, що синтезується, амінокислота приєднується своїм карбоксильним кінцем до З'-концу відповідної молекули тРНК. Цим досягаються дві мети По-перше, і це найбільш важливо, амінокислота ковалентний приєднується до тРНК, що містить правильний антикодон - трехнуклеотидную послідовність, комплемент грехнуклеотидном) кодону що визначає цю амінокислоту в молекулі мРНК. Спаровування кодону з антикодоном дозволяє кожній амінокислоті включитися в зростаючий білковий ланцюг в тому порядку, який диктується нуклеотидной послідовністю мРНК так що генетичний код використовується для перекладу (трансляції).Друга мета, що досягається приєднанням амінокислоти до тРНК, полягає в тому, що амінокислота таким шляхом активується - на її карбоксильному кінці виникає багатий енергією зв'язок, що дає їй можливість реагувати з аміногрупою сусідньої амінокислоти в цій амінокислотній послідовності, т, е. можливість утворити пептидний зв'язок. Цей процес активації - необхідний етап білкового синтезу, оскільки неактивовані амінокислоти не можуть прямо приєднуватися до зростаючого поліпептидного ланцюга. (Спонтанно здатний йти лише зворотний процес - гідролітичний розрив пептидних зв'язків.)Функція тРНК залежить від тривимірної структури її молекули. Декілька видів тРНК вдалося отримати в кристалічному виді, що дозволило визначити їх точну структуру методом рентгеноструктурного аналізу. Для належного згортання молекули тРНК потрібно спаровування комплементу підстав і взаємодію незвичайних підстав (см разд. 3.2.9, мал. 3-16). Вивчення вторинної структури молекули тРНК з багатьох різних організмів показало, що вона має вигляд "конюшинового листа"; вважають, що петлі і прямолінійні відрізки цієї структури потім згортаються додатково, внаслідок чого виникає та, що виявляється кристалографічним аналізом L -кон-формация (мал. 5-7). До одного кінця цієї "букви" приєднується амінокислота, а на іншому кінці знаходиться антикодон (мал. 5-8).У готовому ланцюзі нуклеїнової кислоти нуклеотиди (подібно до амінокислот в білках) можуть зазнавати ковалентну модифікацію, що призводить до зміни активності цієї нуклеїнової кислоти. Такі модифікації посттранскрипцій особливо властиві молекулам тРНК, в яких виявляється багато модифікованих нуклеотидів (мал. 5-9). Деякі з них чинять вплив на конформацію і на спаровування підстав антикодону, що полегшує пізнавання відповідного кодону мРНК молекулою тРНК.

Мал. 5-8. Просторова модель молекули тРНК з приєднаною амінокислотою. Існує багато різних видів тРНК - не менш одного на кожну амінокислоту. Хоча ці молекули тРНК розрізняються по своїй нуклеотидной послідовності, усі вони згорнуті схожим чином. Зображена тут молекула тРНК зв'язує амінокислоту фенілаланін, тому її умовно означають тРНКРЬе (З люб'язного дозволу.

Кожна амінокислота приєднується до відповідної молекули тРНК за допомогою специфічного ферменту [4]. У якому саме місці буде приєднана до зростаючого поліпептидного ланцюга ця амінокислота, залежить не від самої амінокислоти, а від молекули тРНК, що приєднала її. З'ясувати це вдалося за допомогою витонченого експерименту, в якому амінокислоту, приєднану до специфічної тРНК. хімічним шляхом перетворювали на іншу амінокислоту (цистеїн в аланин). Коли потім такі гібридні молекули брали участь в синтезі білку в безклітинній системі, неправильна амінокислота включалася в білковий ланцюг в усіх тих положеннях, які "обслуговувалися" цією тРНК. Успішне декодування, отже, вирішальним чином залежить від точності того механізму, який в нормі забезпечує зв'язок між кожною активованою амінокислотою і відповідною молекулою тРНК.Чому молекула гРНК ковалентний приєднується саме до тієї амінокислоти з усіх двадцяти стандартних амінокислот, яка і є її справжнім партнером? Механізм цей пов'язаний за участю ферментів, званих аминоацил-тРНК-синтетазами. які приєднують кожну амінокислот) до відповідного набору молекул тРНК. Для кожної з амінокислот є своя особлива синтетаза (всього таких синтетаз 20) : одна приєднує гліцин до тРНКс1у, інша - аланин до тРНКА1а і р. д. Реакція приєднання протікає в два етапи, як це видно на мал. 5-10, і призводить до утворення молекули аминоацил-тРНК. Характер зв'язку аминоацил-тРНК ясний з мал. 5-11.Молекули тРНК грають роль кінцевих "адапторов", що переводять інформацію, що знаходиться в нуклеотидной послідовності нуклеїнової кислоти, на мову білку. Не менш важливу роль, проте, грає і другий набір молекул - ферментів аминоацил-тРНК-синтетаз. Таким чином, генетичний код розшифровується за допомогою двох послідовно діючих посередників, кожен з яких здійснює високоспецифічну підгонку однієї молекулярної поверхні до іншої; в результаті спільної дії цих адапуторованих молекул кожна амінокислота може бути ототожнена з певною послідовністю з трьох нуклеотидів в молекулі мРНК, іншими словами, зі своїм кодовому. Основна реакція в синтезі білку - це реакція, що призводить до утворення пептидного зв'язку між карбоксильною групою на кінці зростаючого поліпептидного ланцюга і вільною аміногрупою амінокислоти. Білковий ланцюг синтезується, отже, шляхом її поступового нарощування від кінця аміну до карбоксильного Упродовж усього процесу зростаючий карбоксильний коней поліпептидного ланцюга залишається у активованому стані, будучи пов'язаний ковалентним зв'язком з тРНК (у молекулі пептидж-тРНК). У кожному циклі синтезу відбувається розрив цього ковалентного зв'язку, проте вона тут же заміщається таким самим зв'язком, утворюваною наступною приєднаною до ланцюга амінокислотою (мал. 5-13). Таким чином, в процесі синтезу білку кожна амінокислота, що додається, несе з собою енергію активації, необхідну не для її власного приєднання, а для приєднання наступної амінокислоти. Це один з прикладів "зростання з голови", описаного в гл. 2 (мал. 2-34).Для здійснення реакцій білкового синтезу, які ми тільки що описали, потрібно складний каталітичний апарат Зростаючий кінець поліпептидного ланцюга повинен, наприклад, певним чином підлаштовуватися до молекули мРНК, для того, щоб кожен наступний кодон мРНК міг точно з'єднатися з антикодоном тРНК, не проскочивши ні на один нуклеотид бо це привело б до зрушення рамки прочитування (см разд 3.2.8). Ці і інші етапи білкового синтезу здійснюються рибосомами - великими комплексами, що складаються з молекул білків і РНК. Рибосоми эукариот і прокариот дуже схожі по своїй структурі і функції. Кожна з них складається з двох субодиниць - великої і малої, твірних в сукупності комплекс з масою вПроцес нарощування (элонгации) поліпептидного ланцюга на рибосомах може розглядатися як цикл, що складається з трьох окремих етапів (мал. 5-20). На першому етапі молекула аминоацил-тРНК зв'язується з вільною ділянкою рибосоми, що примикає до зайнятої Р-ділянки. Зв'язування здійснюється шляхом спаровування нуклеотидів антикодону з трьома нуклеотидами мРНК. що знаходяться в А-участке На другому етапі карбоксильний кінець поліпептидного ланцюга відділяється в Р-ділянці від молекули тРНК і утворює пептидний зв'язок з амінокислотою, приєднаною до молекули тРНК в А-участке. Ця реакція каталізується пептидилтрансферазой - ферментом, активність якої залежить від цілісності рибосоми, а гакже, як вважають, від ділянки деякої специфічної області в головній молекулі рРНК великої субодиниці рибосоми. На третьому етапі нова пептидил-тРНК переноситься в Р-ділянку рибосоми, тоді як рибосома просувається уздовж молекули мРНК рівно на гри нуклеотиду. Цей етап вимагає витрати енергії; рушійною силою служить для нього ряд конформаційних змін, що індукуються в одному з компонентів рибосом гідролізом пов'язаної з ним молекули GTP (см разд. 3.4.11).Процес транслокації, що становить третій етап, включає і повернення вільної молекули тРНК, що відокремилася від поліпептидного ланцюга в Р-ділянці під час другого етапу, в цитоплазматичний пул тРНК. Тому після завершення третього етапу незайняті А-участок може прийняти нову молекулу тРНК, навантажену черговою амінокислотою, т. е. цикл може початися знову. У бактерійній клітині тривалість одного циклу элонгации поліпептидною складає за оптимальних умов близько 1/20 с. так що синтез середнього по розмірах білку, що складається з 400 амінокислот, займає приблизно 20 с. Рибосоми просуваються уздовж молекули мРНК у напрямі 5-> 3 , т. е. у тому ж напрямі, в якому йде синтез РНК (див. мал. 5-2).У більшій частині клітин синтез білку - найенергоємніший з усіх біосинтетичних процесів. Утворення кожного нового пептидного зв'язку супроводжується розщеплюванням щонайменше чотирьох високо енергетичних фосфатних зв'язків. Дві з них витрачаються на те, щоб З 64 можливих кодонів мРНК три, а саме ИАА, і АС і ТЮА, є такими, що термінують або стоп-кодонами: вони зупиняють трансляцію. Особливі цитоплазматичні білки, звані чинниками звільнення, безпосередньо зв'язуються з будь-яким стоп-кодоном, А-участка рибосоми, що досягло. Це зв'язування змінює активність пептидилтрансферазы. Фермент із зміненою активністю приєднує тепер до пептидил-тРНК не амінокислоту, а молекулу води. Внаслідок цього карбоксильний кінець зростаючого поліпептидного ланцюга відділяється від молекули тРНК А оскільки зростаючий поліпептид утримується на рибосомі тільки за допомогою його зв'язку з молекулою тРНК, завершений білковий ланцюг виявляється вільним і, відокремившись від рибосоми, негайно поступає в цитоплазму (мал. 5-21). Після цього рибосома звільняє мРНК і розпадається на дві субодиниці; ці субодиниці можуть потім об'єднатися на іншій молекулі мРНК і почати новий цикл білкового синтезу за допомогою процесу, який ми опишемо нижче