Тема9. Методи виділення та фракціонування клітин.

Існує декілька методів для введення в клітини молекул, не проникаючих через мембрану [17]Іноді виникає потреба введення в клітини молекул, не проникаючих через мембрану. Це можуть бути светоизлучающие індикатори (як акварин), клітинні білки, пов'язані з флуоресцентною міткою, молекули, які чинять вплив на поведінку клітин. Один з підходів полягає в мікроін'єкції молекул в клітини за допомогою скляної мікропіпетки. Це дуже ефективна методика, суть якої полягає в наступному : очищений білок зв'язується з флуоресцентною міткою і потім його ін'єктують в Мікроін'єкції - дуже ефективний і досить широко використовуваний метод, проте важливо пам'ятати, що в даному випадку процедурі мікроін'єкції піддається кожна клітина окремо, тому кількість клітин, які можна спостерігати одночасно, обмежена. Існують методи, що дозволяють одночасно підвищувати проникність клітинних мембран у безлічі клітин, що становлять клітинні популяції. Для цього використовують потужний електричний розряд або хімічну дію, наприклад, розчином детергента.Для внутрішньоклітинного введення речовин, не проникаючих через клітинну мембрану, використовують три методи. А. Речовину в клітину вводять за допомогою мікропіпетки за рахунок гідравлічного тиску поршня або електричного заряду молекул, що вводяться, внаслідок чого речовина проникає в клітину у вигляді потоку іонів (метод іонофорезу). б. Клітинна мембрана під дією короткого і потужного електричного розряду (2000 в/см протягом 200 мке) порушується, що забезпечує входження в клітину певних речовин. В. Використане злиття мембран. На початку процедури отримують бульбашки, оточені мембранами (ліпосоми). Потім ліпосоми завантажують необхідною речовиною, змішуючи концентрований розчин цього вешества і суспензію фосфоліпідів. Інша модифікація цього методу включає на першому етапі порушення мембрани еритроцитів, що призводить до втрати ними клітинного вмісту, і наступне приміщення отриманих "тіней еритроцитів" в розчинпотрібної речовини, де відбувається їх заповнення і затягування плазматичних мембран. Обидва види носіїв (як ліпосоми, так і "тіні еритроцитів") можна вводити в клітини-мішені за рахунок злиття мембран під дією певних вірусних білків (тих, що синтезуються вірусомдля полегшення проникнення в клітини).низькій концентрації. Електричний розряд створює в плазматичній мембрані великі пори без ушкодження внутрішньоклітинних мембран. Ці пори залишаються відкритими протягом декількох хвилин і навіть годинника залежно від типу клітин і інтенсивності електричної дії. Через ці пори навіть макромолекули можуть швидко входити в цитозоль або покидати його. При обмеженій дії мембрана у значної частини клітин відновлюється і клітини виживають. Третій метод введення в клітини великих молекул полягає в злитті часток, оточених мембраною і що ВисновокВимір концентрації і розподілу неорганічних іонів і інших низькомолекулярних речовин в клітинах необхідно виконувати на інтактній живій тканині. Дуже ефективний для цього ядерний магнітний резонанс (ЯМР) ЯМР є повністю неінвазивним методом, він використовується для виміру відносної концентрації багатьох малих молекул, але, на жаль, його застосування вимагає значної кількості зразка. Для визначення концентрації специфічних іонів в окремих клітинах або в окремих частинах клітин можна застосовувати флуоресцентні індикаторні барвники. Скляні мікроелектроди незамінні для виміру не лише електричних потенціалів і потоку іонів через плазматичну мембрану; з їх допомогою вдається визначати концентрацію специфічних вттриклеточных іонів. Мікроелектроди можна використовувати і для ін'єкції в клітини молекул, не проникаючих через мембрани Альтернативні підходи полягають в тимчасовому підвищенні проникності мембран або в злитті клітин з частками, оточеними мембранами і що містять макромолекули.