7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка – основа для создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка – это возвращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механических повреждениях; кроме того, необходимо присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют:

• 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту),

• ИУК (индолил-3-уксусную кислоту),

• НУК (α-нафтилуксусную кислоту),

Из цитокининов вносят:

• кинетин,

• 6-БАП (6-бензиламинопурин),

• зеатин.

Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. То есть действие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. Сначала они теряют запасные вещества, затем специализированные клеточные органеллы.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in virto начинается новый синтез белка. При культивировании клеток на питательной среде начинается каллусогенез, то есть в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализированная клетка растущей ткани становится каллусной в результате дедифференцировки, то есть восстановления у нее способности к делению.

7.4 Типы культур клеток и тканей

В зависимости от способов, условий и происхождения можно выделить несколько типов культур клеток и тканей.

С помощью обработки ферментами суспензии можно получить и из плотных тканей, и из тканей средней плотности.

7.5 Общая характеристика каллусных клеток

Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание.

Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения, из которого они были получены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозоустойчивость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоленение, фотопериодическая реакция), а главное, способность к синтезу вторичных метаболитов.

Наряду с общими у каллусных клеток появляются свои, характерные для них, особенности. Например, длительно культивируемые in vitro клетки высших растений образуют специфическую популяцию, относящуюся к типу неполовых – популяции соматических клеток. Наиболее характерные свойства этой популяции: физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность, гормоннезависимость.

– Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый данный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Общее физиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток.

– Генетическая гетерогенность – нестабильность генома. Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплодия, анеуплодия, хромосомные изменения, генные мутации.

Полиплодия – наследственное изменение, заключается в кратном увеличении числа наборов хромосом в клетках организма (часто встречается у растений, редко – у животных). Полиплоды могут содержать в клетке три основных набора хромосом (триплоид), четыре набора (тетраплоид).

Анеуплодия – различные формы аномалий в числе хромосом.

Однако генетическую гетерогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием следующей популяции клеток и служит основой для их адаптации. Это свойство имеет важное значение для селекции.

– Гормоннезависимость. Хотя гормоны и вызывают мутации, каллусные ткани от большинства растений образуются только в присутствии в питательной среде и ауксинов, и цитоксинов. Однако, при длительном культивировании практически у всех тканей может возникнуть специфическое свойство гормоннезависимости, то есть автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на раковые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей.

Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свойство автономности от присутствия гормонов, называют «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клетками, называют «химическими» опухолями, в отличие от растительных или генетических опухолей. Генетические опухоли возникают на межвидовых гибридах растений, растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение, чаще всего вызываются у растений агробактериями.