Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

лаборатория биотехнологии

Отчет по летней практике:

Получение рекомбинатного интерлейкин 3 человеческого.

Работу выполнил: Ханнанов Ринат Асхатович

Научный руководитель: Есипов Роман Станиславович

Москва 2010 год Содержание

Список сокращений…………………………………………………………..…3

Введение………………………………………………………………………..…4

Цели и задачи ……………………………………………………………………5

Экспериментальная часть……………………………………………………...6

Материалы………………………………………………………………………………....6

Методы……………………………………………………………………………………...8

Результаты и обсуждение……………………………………………………...12

Выводы…...……………………………………………………………………...14

Список сокращений

Amp - ампицилин

IPTG - изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид

ПААГ – полиакриламидный гель

PMSF – фенилметилсульфонилфторид

TEMED – N,N,N,N–тетраметилэтилендиамид

SDS – додецилсульфат натрия

EDTA – этилендиаминтетрауксусная кислота

Трис – трис(гидроксиметил)метиламин

ДМФА – диметилформамид

IL-3 интерлейкин 3

Введение

Летняя практика проходила в Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, лаборатории биотехнологии в группе синтеза рекомбинантых белков и пептидов под руководством к.х.н. Есипова Р.С. Практика включала в себя ознакомление с методами биотехнологии и знакомством с аппаратурой данной исследовательской группы, а также формирование целостного представления о биотехнологическом процессе. За период с 14.06.10 по 23.07.10 была осуществлена работа по получению рекомбинанткого белка (интерлейкина 3 человеческого) биотехнологическим методом.

Цели и задачи

Целью данной работы было получение рекомбинантного Интерлейкина 3 с использованием технологии рекомбинантной ДНК. В качестве экспрессионной системы для продукции рекомбинантного белка была использована ранее сконструированная в данной лаботатории плазмида pER IL3. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Освоить методы трансформации бактериальных клеток плазмидными векторами, наработку биомассы, солюбилизацию телец включения.

2. Подобрать условия для ренатурации.

Экспериментальная часть Материалы

Реактивы.

В работе использованы: Трис, соляная кислота, акриламид, N,N – мителенбисакриламид, персульфат аммония, ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, β-меркаптоэтанол, бакто-триптн, дрожжевой экстракт, IPTG, хлорид натрия, хлорид кальция, мочевина, ЭДТА, изопропанол, глицерин, PMSF, ампициллин, бромистый этидий,

Плазмидный вектор

pER Il 3 производный pET23d(+) (Novagen)

Бактериальные штаммы.

E. coli ER2566

F^- λ- fhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene 1 gal sulA11 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2 R(zgb-210::Tn10)(TetS) endA1 [dcm]

E. coli XL

endA1 gyrA96(nal^R) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB⁺ lacI^q Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK^- mK⁺)

Лабораторное оборудование.

В работе использовали напольные центрифуги с охлаждением Cryofuge 20-3 (Heraus, Германия), настольную центрифугу с охлаждением Z-383-K (Hermle, Германия) качалку с термостатируемой камерой Certomat U, термостат «Гном» (ДНК-технология, Россия), 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB) Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia), ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius), спектрофотометр U-2900, ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.), УФ-трансиллюминатор (Desaga), весы аналитические, автоматические микропипетки (Gilicon, Eppendorf).

Буферы и растворы.

Буфер А (50 мМ Tris, pH 8,5, 250 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА)

50×TAE (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе); 2 М трис-ацетат, pH 8,0, 1 М ацетат натрия, 0,9 М NaCl, 50 mM EDTA.

40 % акриламид / 1,3 % N,N’ – мителенбисакриламид в воде.

2×YT питательная среда: 1,6 % бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 1% хлорид натрия, pH 7,3

Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:

LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис –HCl, pH 8,8. 0,1 % SDS.

UTB (буфер для концентрирующего геля ) 125 мМ трис-HCl, pH 6,8. 0,1% SDS

Буфер для приготовления образцов: 1 мл UTB; 0,8 мл 10% SDS; 100 мкл β-меркаптоэтанола, 0,01 г бромфенолового синего; 400 мкл глицерина; 1,7 мл дис., воды.

Рабочий электродный буфер: 0,025 М Tris; 0,192 М глицин; 0,1 % SDS.

Стоковые растворы:

Стоковый раствор бромистого этидия 1 г бромистого этидия на 10 мл 96% этилового спирта.

Стоковый раствор ампицилина 1 г ампицилин хлорида на 10 мл ДМФА.

Стоковый раствор PMSF 1 г PMSF на 10 мл дист., воды.

Методы

Приготовление компетентных клеток

Растили ночную культуру E. coli ER 2566 в питательной среде при 37^о С. Ночную культуру развели светлой питательной средой в 100 раз и растили до А₆₀₀ = 0,2; затем охладили во льду. Перенесли 100 мл культуры в центрифужную пробирку и осадили клетки центрифугированием 20 мин., 3000 об/мин при 4^оС. Декантировали супернатант и ресуспендировали осадок в 50 мл 0,1 М CaCl₂ предварительно охлаждённого во льду и оставили во льду на 20 минут. Осадили клетки центрифугированием при 3000 об/мин в течении 20 мин., при 4^оС. Декантировали супернатант и ресуспендировали осадок в 5 мл 0,1 М CaCl₂ и оставили во льду на 15 минут. Добавили 1 мл 80% глицерина, охлаждённого во льду и оставили во при 0^оС на 15 мин. Расфасовали полученные компетентные клетки в эпиндорфы по 250µl. Заморозили в житком азоте и убрали на – 70^оС.

Наработка плазмидной ДНК pER IL-3

В качестве клеток в которых, нарабатывалась плазмидная, ДНК использовали штамм E. coli XL. Их трансформировали плазмидой pER IL3. Для этого к 250 мкл суспензии компетентных бактериальных клеток добавили 3 мкл плазмидной ДНК и инкубировали 10 мин при 0^о С. Затем данную суспензию подвергли тепловому шоку поместив микропробирку с содержимым в термостат на 2 мин при 42 С. По истечении указанного времени бактериальную суспензию вновь поместили в 0^о С на 2 минуты, а затем всё содержимое микропробирки перенесли в ёмкость с питательной средой объёмом 5 мл содержащей ампицилин в концентрации 100 мкг/мл и оставили инкубироваться с интенсивным перемешиванием на 2 часа при 37^o С. Полученную бактериальную суспензию растирали на агарозной селективной среде содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг на мл среды и инкубировали при 37^оС в течении ночи. Перенесли несколько образовавшихся колоний в жидкую питательную среду LB и инкубировали всю ночь. Бактериальную суспензию центрифугировали при 4000 об/мин в течении 7 мин, а из полученного бактериального осадка выделяли плазмидную ДНК pER IL3 с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), по протоколу фирмы изготовителя.

Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Для приготовления геля выбранной концентрации, навеску лиофилизированного порошка агарозы растворили в 1×TAE-буфере и выдержали 6 минут в СВЧ-печи до полного растворения (расплавления). Выбор концентрации агарозы и, следовательно, пористости геля определялся размерами фракционируемых макромолекул; для плазмидной ДНК использовали 1% гель. В расплавленный раствор агарозы вносили стоковый раствор бромистого этидия до концентрации 100 мкг/мл. Раствор агарозы заливали в горизонтальную электрофоретическую ванночку со встроенной гребёнкой и после образования геля наносили образцы объёмом 5 мкл. Камеру присоединяли к источнику постоянного тока напряжение 380 в сила тока 22 мА. Электрофоретическое разделение проходило в течении 15 мин. Наличие плазмидной ДНК устанавливали визуально с помощью ультрафиолетовой лампы.

Получение биомассы клеток E. coli ER2566/IL-3

Трансформировали E. coli ER2566 плазмидой pER IL-3. Для этого к 250 мкл суспензии компетентных бактериальных клеток добавили 3 мкл плазмидной ДНК pER IL-3 и инкубировали 10 мин при 0^о С. Затем данную суспензию подвергли тепловому шоку поместив микропробирку с содержимым в термостат на 2 мин при 42 С. По истечении указанного времени бактериальную суспензию вновь поместили в 0^о С на 2 минуты, а затем всё содержимое микропробирки перенесли в ёмкость с питательной средой объёмом 5 мл содержащей ампицилин в концентрации 100 мкг/мл и оставили инкубироваться с интенсивным перемешиванием на 2 часа при 37^o С. Спустя 2 часа содержимое пробирки перенесли в коническую колбу содержащую питательную среду (2×YT) объёмом 300 мл и оставили инкубироваться с интенсивным при 37^o С на всю ночь. Ночную культуру разделили на 6 равных порций по 50 мл. Каждую порцию добавили в колбу, содержащую 300 мл питательной среды с ампицилином в концентрации 100 мкг/мл. Все 6 колб установили в шейкерный термостат. Инкубацию проводили при интенсивном перемешивании при 37^о С периодически замиряя оптическую плотность инкубационной смеси через каждые пол часа после начала интенсивного изменения измеряемой величины. После превышения значения оптической плотности 0.8 единиц в каждую колбу содержащую данную бактериальную суспензию добавили IPTG до концентрации 100 мкг/мл и продолжили инкубировать при прежних условиях 3 часа. Спустя указанное время инкубацию прекратили, бактериальную суспензию отцентрифугировали при 4000 мин 20 мин, супернатант отделили от осадка, осадок взвесили и поместили на -20 С.

Выделение телец включения из биомассы

Биомассу гомогенизировали в буфере А в соотношении 1г биомассы 20 мл буфера А с добавлением PMSF до концентрации 1 мМ. После достижения гомогенного состояния использовали ультразвук для разрушения бактериальных клеток. Процесс ультразвуковой дезинтеграции проводили при пониженной температуре близкой к 0^о С. После полного разрушения клеток, полученную суспензию подвергли центрифугированию при 12000 мин 17 минут при 12^о С. Образовавшийся осадок отделили от супернатанта и поместили на – 20^о С.