Катаболизм и энергия

Необходимая связь между катаболизмом и анаболизмом определяется возможностью заставить катаболический процесс управлять синтезом химически активных реагентов, число которых мало, и которые, в свою очередь, используются для управления всеми анаболическими реакциями. Эти главные (ключевые!!!) промежуточные соединения, из которых наиболее важным является аденозин-5-трифосфат (АТФ), имеют то, что биологи называют «макроэргической связью»; в АТФ это - ангидридная связь в пирофосфатном остатке. Прямо или косвенно потенциальная энергия, выделяющаяся при разрыве этой связи, используется для шагов формирования химических связей в анаболических синтезах. Такие молекулы, как АТФ, запасают «энергетическую валюту» клетки. Когда АТФ используется в реакции биосинтеза, он генерирует образование аденозин-5-дифосфата (АДФ) или реже аденозин-5-монофосфата (АМФ) в качестве продуктов гидролиза:

(где А и В – углерод-содержащие метаболиты клетки, Ф_i - неорганический фосфат, а ФФ_i - неорганический пирофосфат).

АДФ, который все еще обладает макроэргической связью, также может быть использован для получения АТФ посредством аденилат-киназной реакции:

АДФ + АДФ → АТФ + АМФ

Реакции фосфорилирования, которые являются очень распространенными в живых клетках, обычно протекают при посредничестве АТФ:

Фосфорилированный продукт обычно является химически более активным (в одном или нескольких проявлениях), чем исходное соединение.

Катаболические пути

Общие соображения по поводу расщепления глюкозы.

Целью расщепления субстрата является обеспечение микроорганизмов:

• строительными элементами для синтеза новых клеток;

• энергией, главным образом, в форме АТФ, с помощью которой образуются новые связи и синтезируются новые соединения;

• восстановительным потенциалом, главным образом в виде восстановленной формы НАД (т.е. НАДН) или восстановленной формы НАДФ (т.е. НАДФН).

И АТФ, и НАД(Ф)Н (который может использоваться для обозначения восстановленных НАД и НАДФ) «работают», превращая одно соединение в другое, при коньюгировании с различными ферментами.

Несмотря на то, что микробная клетка может рассматриваться как обширная коллекция соединений, ее можно упростить, представив как состоящую из следующих соединений:

• белки, которые могут быть либо функциональными (такие, как ферменты), либо структурными (такие, как некоторые белки, образующие клеточную стенку или архитектуру внутриклеточных структур);

• нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК);

• жиры, в основе которых часто лежат жирные кислоты, используются для образования мембранных структур, окружающих либо всю клетку, либо органеллу внутри клетки;

• полисахариды, которые используются преимущественно для построения клеточных стенок и клеточных капсул.

Вышеперечисленные соединения, в свою очередь, состоят из простых предшественников:

• белки - из аминокислот;

• нуклеиновые кислоты - из гетероциклических оснований нуклеиновых кислот (плюс рибоза и фосфат);

• липиды - из жирных кислот, которые, в свою очередь, синтезированы из ацетата (С₂);

• полисахариды - из сахаров.

Следовательно, в принципе, можно выделить только девять предшественников, из которых клетка может создать все свои молекулы и, конечно, размножиться (см. Рис. 3).

Рис. 3. Анаболические пути (синтетические процессы) и центральные катаболические пути. Показаны только главные биосинтетические процессы и их основные связи с катаболическими путями, все в очень упрощенной версии. Связи, осуществляющиеся через «энергию» (АТФ) или окислительно-восстановительный (НАД⁺, НАДР⁺) метаболизм азота, и т.п., опущены. – фосфатные группы. (ПОБ – поли-β-оксибутират, Р – фосфатные группы.) Девять главных предшественников расположены в затененных рамках.

Таким образом, так долго, насколько клетка может создавать эти базовые 9 молекул из любого субстрата или сочетания субстратов, она может себя воспроизводить (при условии, конечно, что при образовании этих предшественников образуются также АТФ и восстановленный НАД[Ф]Н).

Если мы рассматриваем глюкозу как обычный ростовой субстрат для микробной клетки, мы можем показать, как она расщепляется на эти 9 основных предшественников (Рис. 3). Их образование связано с процессом гликолиза, который иногда называют путем Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (EMP – Embden-Meyerhof-Parnas), а затем через дальнейшее окисление пирувата (как конечного продукта гликолиза) и через реакции цикла трикарбоновых кислот.

Помимо гликолитического процесса имеется к нему дополнительный цикл, который отвечает за образование пентозо- (С₅) и тетрозо-фосфатов (С₄). Этот пентозо-фосфатный цикл иногда называют гексозо-монофосфатным путем или «шунтом» (запасной путь) (см. рис. 4).

Этот путь имеет двойную цель:

• обеспечить С₄- и С₅-блоки для биосинтеза (см. рис. 3) и

• произвести НАДФН для биосинтеза.

Рис. 4. Пентозо-фосфатный цикл (гексозо-монофосфатный шунт). (1) – глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, (2) – фосфоглюконат-дегидрогеназа. На левой вставке суммарно показана стехиометрия рециклизации фруктозо-6-фосфата в глюкозо-6-фосфат соответствующей изомеразой; глицеральдегид-3-фосфат также может быть рециклизован при обращении гликолиза. С полными обращениями данный путь функционирует как генератор НАДФН, однако трансальдолазная и транскетолазная реакции также позволяют сахарам взаимопревращаться для использования в других путях.

Суммарная реакция:

Глюкоза + АТФ + 6НАДФ⁺ → глицеральдегид-3-фосфат + АТФ + 6НАДФН

Любое использование С₅- или С₄-сахаров для биосинтетических процессов тормозит рециклизующий процесс и, таким образом, снижает выход НАДФН.

Несмотря на то, что в гликолизе и в пентозо-фосфатном цикле используется глюкоза-6-фосфат, степень задействованности каждого из путей в значительной степени зависит от того, что клетка делает в настоящий момент. Например, эти два пути задействованы приблизительно в отношении 2:1 в период наиболее активного роста клетки. Однако по мере замедления роста способность клетки к биосинтезу снижается, требуется меньше НАДФН, фосфатов С₅- и С₄-сахаров, поэтому отношение между этими путями стремиться к 10:1 или даже 20:1.

Следовательно, очевидным является то, что пути метаболизма являются контролируемыми системами, способными значительно совершенствоваться, чтобы соответствовать изменяющимся потребностям клетки. Данный вопрос обсуждается ниже (см. лекцию 10, раздел «Контроль метаболических процессов»).

Несмотря на то, что Г и ПФЦ обнаружены у большинства микроорганизмов, некоторые бактерии имеют свой альтернативный путь. Это путь Энтнера-Дудорофа (Entner-Doudoroff) (см. рис. 5), который реализуется в псевдомонадах и родственных бактериях. Тем не менее, ПФЦ у этих бактерий все же реализуется, т.к. путь Entner-Doudoroff не генерирует фосфаты С₅- и С₄-сахаров.

Рис. 5. Путь Энтнера-Дудорофа, который иногда заменяет гликолиз у псевдомонад и родственных бактерий. Глицеральдегид-3-фосфат превращается в пируват соответствующими ферментами гликолитического цикла.

Цикл трикарбоновых кислот.

Расщепление глюкозы, каким бы ни был путь или пути, неизменно приводит к образованию пировиноградной кислоты СН₃-СО-СООН. Поведение пирувата различно у аэробных и анаэробных организмах. В аэробных системах пируват декарбоксилируется (т.е. теряет СО₂) и одновременно активируется в химическом смысле, превращаясь в ацетил-коэнзим А (аббревиатура ацетил-СоА) в сложной реакции, которая использует также НАД⁺:

Пируват + СоА + НАД⁺ → Ацетил-СоА + СО₂ + НАДН

Эта реакция катализируется пируват-дегидрогеназой. Поведение пирувата в анаэробных клетках описывается ниже.

Ацетил-СоА, являясь тио-эфиром, характерен высокой химической активностью. Он способен образовывать большое количество промежуточных соединений, однако его основная линия поведения заключается в том, что он постепенно окисляется через циклическую серию реакций, известных как цикл лимонной кислоты или цикл Кребса (в честь ученого Krebs, открывшего его).

Этот цикл выполняет две существенные функции:

• обеспечивает главные промежуточные соединения для реакций биосинтеза (см. рис. 2), основными из которых являются 2-оксоглутарат (синтез глутамата, а из него - глутамина, аргинина и пролина), сукцинат (синтез порфиринов) и оксалоацетат (синтез аспартата и аминокислот его семейства);

• дает энергию, выделяющуюся при полном окислении ацетил-СоА до СО₂ и Н₂О (это процесс детально описан в разделе настоящей лекции «Производство энергии аэробными микроорганизмами).

Цикл лимонной кислоты, тем не менее, не может выполнять какую-либо одну функцию: если промежуточное соединение забирается для биосинтеза, тогда обязательно приносится в жертву некоторое количество высвобождающейся энергии; если окисляется ацетил-СоА до СО₂ и Н₂О, то для биосинтеза не останется никаких промежуточных соединений. Вследствие этого цикл протекает в виде балансировки между двумя целями. Пируват, образующийся из глюкозы, обеспечивает поступление, а цикл обеспечивает отток энергии и предшественников (см. рис. 6).

Рис. 6. Диаграммное представление двойственной роли цикла трикарбоновых кислот: вырабатывать предшественники и энергию (АТФ).

Реализуя свое двойное назначение, цикл не может полностью пополнять исходный оксалоацетат, необходимый в качестве первичного реагента для образования цитрата, т.к. некоторые из промежуточных соединений должны быть неизбежно использованы для биосинтетических целей. (Если бы они не были использованы таким образом, в цикле не было бы ни одного места, в котором производится энергия, т.к. она не могла бы затем быть использованной ввиду того, что биосинтез не может быть реализован без предшественников). Поэтому важно, чтобы бы существовал второй путь, посредством которого может образовываться оксалоацетат, и он реализуется через карбоксилирование пирувата:

Пируват + СО₂ + АТФ → Оксалоацетат + АДФ + Ф_i

Эта реакция инициируется пируваткарбоксилазой. Однако, поскольку оксалоацетат тоже образуется в результате работы цикла, карбоксилирование пирувата должно регулироваться так, чтобы ацетил-СоА и оксалоацетат всегда образовывались в равных количествах. Это обычно достигается пируваткарбоксилазой, активность которой зависит от ацетил-СоА как положительного эффектора (см. лекцию 10, раздел «Контроль метаболических процессов»), т.е. эффектора, повышающего ее активность. Чем больше количество ацетил-СоА, тем быстрее проходит образование оксалоацетата.

Поскольку оксалоацетат и ацетил-СоА удаляются одинаково (на образование цитрата), то концентрация ацетил-СоА падает; активность пируваткарбоксилаза снижается; но поскольку пируватдегидрогеназа функционирует как прежде, то образуется большее количество ацетил-СоА. Значит, синтез лимонной кислоты не только будет продолжаться, но также будут всегда уравновешиваться 2 реакции, в результате которых образуются предшественники цитрата (Рис. 7). Этот тип реакции, катализируемый пируваткарбоксилазой, называется анаплетотической реакцией, что означает «пополняющая» реакция.

Рис. 7. Каким образом клетка обеспечивает эквимолярную поставку оксало-ацетата и ацетил-СоА для синтеза лимонной кислоты: активность пируват-карбоксилазы стимулируется ацетил-СоА, который вырабатывается пируват-дегидрогеназой.

Обвод глиоксилата для роста на С₂-соединениях.

Если организм растет на С₂-соединении, или на жирной кислоте, или углеводороде, или на любом субстрате, который расщепляется главным образом на С₂-единицы (см. раздел этой лекции «Источники углерода, отличные от глюкозы»), то цикл трикарбоновых кислот является недостаточным для обеспечения его метаболизма. Ацетил-СоА может быть получен непосредственно из ацетата, если он используется как источник углерода, или из С₂-соединения, которое восстановлено в большей степени, чем ацетат, т.е. из ацетальдегида или этанола:

Способ, по которому ацетат превращаются в С₄-соединения, известен как обвод глиоксилата (см. Рис. 8), для которого требуется еще два фермента в дополнение к ферментам цикла трикарбоновых кислот: изоцитратлиаза и малатсинтетаза. Первый фермент расщепляет изоцитрат на сукцинат и глиоксилат. Второй фермент использует второй ацетил-СоА и присоединяет к глиоксилату, в результате чего образуется малат. Оба эти фермента индуцируются, т.е. синтезируются только тогда, когда подается специфический сигнал (см. лекцию 10, раздел «Контроль синтеза ферментов»), если микроорганизмы выращивают на С₂-соединениях.

Рис. 8. Обвод глиоксилата – дополнительные реакции к циклу Кребса. Схема также показывает, как функционирует обводной путь для достижения образования сахаров из ацетил-СоА с включением дополнительно реакции (1), катализируемой фосфоэнолпируваткарбоксикиназой, начинающей обратный гликолиз.

Активность обоих ферментов возрастает примерно в 20-50 раз в таких условиях роста. Обвод глиоксилата не заменяет работу цикла трикарбоновых кислот; например, остается необходимость получения 2-оксоглутарата (из изоцитрата) для поставки глутамата в систему синтеза белка и т.д. Сукцинат, являясь вторым продуктом изоцитратлиазы, как и прежде будет претерпевать превращение с образованием мелата, а из него - оксалоацетата. Таким образом, посредством реакций глиоксалатного цикла из С₂-единиц могут быть получены С₄-соединения, которые затем поставляются для синтеза всех метаболитов клетки (см. Рис. 3). Их преобразование в сахара подробно изложено в этой лекции, раздел «Глюконеогенез».

Источники углерода, отличные от глюкозы.

Любое соединение, которое используется микроорганизмом и может стать предшественником любого промежуточного соединения гликолиза, или даже цикла трикарбоновых кислот, может превращаться организмом с помощью имеющегося у него набора ферментов. Впрочем, микроорганизмы перерабатывают значительно большее число всевозможных субстратов. Другими словами, во всех природных соединениях заложена способность к расщеплению, и максимальный потенциал этой расщепляющей активности обнаружен в микробных системах. Использование микроорганизмов в качестве «бросовых одноразовых единиц», естественно, является обширным, а такая деградирующая активность составляет неотъемлемую часть биотехнологии защиты окружающей среды.

Как иллюстрацию этого разнообразия, рассмотрим пример расщепления микробами жирных кислот. Способность микроорганизмов расти на жирах растительного и животного происхождения является широко распространенной. Одно из отличий жиров растительного и животного происхождения заключается в том, являются они жидкими или твердыми при температуре окружающей среды; химический состав их одинаков, т.е. они являются триэфирами жирных кислот глицерина. Жирные цепочки обычно состоят из 14, 16 или 18 углеродных атомов; длинная цепочка алкила может быть насыщенной, как уже отмечалось, или может иметь одну или больше двойных связей, обеспечивающих образование ненасыщенных и полиненасыщенных ацильных групп.

При добавлении в культуры микробов растительные жиры первоначально гидролизуются ферментом липазой на составляющие: жирные кислоты и глицерин. Последний затем претерпевает метаболизм по пути превращения в глицеральдегид-3-фосфат (см. гликолиз). Жирные кислоты поступают в клетку и мгновенно превращаются в соответствующий тиоэфир-СоА. Эфиры ацил-СоА расщепляются в циклической последовательности реакций, в которой цепочка жирного ацила постепенно укорачивается в результате потери двух атомов углерода, отщепляющихся в виде ацетил-СоА. Процесс этот известен как цикл -окисления, поскольку первоначальное воздействие на цепочку жирной кислоты происходит в позиции  или 3. Каждое повторение цикла дает более короткий эфир ацил-СоА. Этот эфир снова проходит последовательность из четырех реакций (ацил-СоА-оксидаза [грибы]/ацил-СоА-дегидрогеназа [бактерии] → 2,3-энол-СоА-гидротаза [кротоназа] → 3-гидроксиацил-СоА-дегидрогеназа → 3-оксоацмл-СоА-тиолаза) до тех пор, пока не синтезируется бутирил-СоА, из которого затем образуется две молекулы ацетил-СоА.

Если микробы используют ненасыщенные жирные кислоты, может потребоваться некоторое перемещение двойной связи в правильное -положение для получения конфигурации ацил-СоА, которая может атаковаться вторым ферментом цикла – гидратазой.

При расщеплении жирных кислот высвобождается энергия в виде тепла, а не метаболически используемая энергия в виде АТФ. Это происходит путем переокисления ФАДН₂ до О₂, который затем образует Н₂О₂. Перекись водорода разлагается на Н₂О и 1/2О₂ с выделением значительного количества тепла. Таким образом, микроорганизмы, растущие на жирных кислотах и родственных соединениях (например, длинные цепочки алканов), неизменно выделяют значительное количество тепла.