26. Количественная оценка роста микроорганизмов. Чистые и смешанные культуры микроорганизмов.

В результате роста и размножения в питательной среде увеличивается количество клеток. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не для индивидуального организма, а для популяции.

Для характеристики физиологического развития культуры микроорганизмов и используют следующие параметры:

· концентрация клеток (клеток/мл)

Количество биомассы можно характеризовать по сухой массе клеток на единицу объема (мг/л, г/л кг/м), в том случае если клетки имеют примерно одинаковые размеры – по числу клеток в единице объема (млн./мл, млрд./мл).

· время генерации – промежуток времени, за который число клеток удваивается;

· константа скорости деления – число удвоений в час;

· скорость роста культуры – изменение количества биомассы в единицу времени;

· константа скорости роста.

Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом (прямой метод) с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева).

Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве. Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 "С

Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца.

Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.

Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен. В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование С02 или кислот) 

Чистая культура - культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного  вида, являющихся потомками одной бактериальной клетки. Получить чистую культуру, с несомненностью доказать ее чистоту и уберечь от загрязняющих организмов - главная задача микробиолога. Чистые культуры микроорганизмов, за редкими исключениями, выделяют на поверхности или внутри твердой питательной среды. Процедура начинается с отделения от клеточной популяции одной - единственной клетки, причем вырастающая из клетки колония тоже должна оставаться изолированной от других клеток и колоний. Аэробные бактерии выделяют по методу Коха - рассеивают суспензию по поверхности среды в чашках Петри или применяют менее трудоемкий метод - размазывают каплю платиновой петлей по агаризованной среде. Анаэробные бактерии суспендируют в расплавленном агаре (45°С) и проводят инкубацию без доступа воздуха. Тщательное отделение одной колонии, повторное суспендирование в жидкой среде и повторное нанесение штриха или разведение в агаре позволяют получать чистые культуры большинства микроорганизмов.

Чистая культура используется:

1. в научных исследованиях;

2. при диагностике инфекционных заболеваний

3. как исходный материал для производства вакцин, ферментов, антибиотиков, витаминов, гормонов и др.;

4. в промышленном производстве (молочнокислые закваски, пивные и обычные дрожжи и т.д.).

Смешанная культура - культура бактерий разных видов, первоначально взятое из естественных источников (воздуха, воды, почвы) и культивированное (выращенное) в лабораторных условиях. Между ними существуют самые различные формы взаимодействия; это может быть конкуренция за общий субстрат, комменсализм или мутуализм. Для изучения этих и других форм взаимодействия все чаще используют смешанные культуры. Если создать определенные заданные условия, то как в периодических, так и в непрерывных проточных культурах можно наблюдать последовательную смену (сукцессию) от дельных организмов и накапливаемых продуктов обмена. Это в свою очередь позволяет делать выводы о синэргистических или антагонистических взаимоотношениях между различными организмами. Смешанные культуры могут быть приготовлены путем объединения чистых культур. Исследования, проводимые на смешанных культурах заданного состава, дают возможность понять, какими могут быть сложные формы взаимодействия микроорганизмов в местах их естественного обитания.

Смешанная культура дает определение о поведении микробов «в естественной среде». То есть ученые получают возможность проследить за взаимодействием бактерий различного вида, появлением новых свойств, присущих микроорганизмам, только в «сожительстве» с другими видами. В отличие от математических законов в случае со смешанной культурой ее свойства не являются суммой свойств микробов, входящих в нее. Напротив, свойства такой субстанции могут сильно отличаться от характеристик составляющих ее микроорганизмов при их посеве и культивировании в изоляции (чистая культура). Особую важность определение смешанной культуры приобретает в медицине, при исследовании взаимодействия различных инфекций с микрофлорой организма. То есть определение заболевания основано на выведении чистых культур, а для полного изучения болезни в развитии необходимо исследовать смешанные культуры

Для выведения чистой культуры существует несколько различных методов:

Метод Луи Пастера (французский химик, один из основоположников микробиологии). Суть метода в последовательном разведении изучаемого образца в жидкости (в пробирке) до получения единичной клетки в заданном объеме. Этот метод интересен скорее в историческом, чем в практическом плане.

Метод Роберта Коха (немецкий микробиолог). При этом способе исследования материал разводят в агар-агаре (при t⁰ 48-50), который затем разливают по чашкам Петри и дают застыть. Для посева (разлива) используют несколько последних разведенных образцов, где количество клеток значительно меньше. В дальнейшем это облегчает определение в глубине агар-агара и перенос колоний (скопление микробов, выросшее из единичной клетки) на другие питательные среды для непосредственного выведения чистой культуры.

Метод Дригальского (немецкий исследователь). Пожалуй, самый распространенный вариант исследования. Метод состоит в том, что материал для анализа разводят в пробирке физраствором или бульоном, затем единственную каплю из пробирки переносят в чашку Петри (делают посев) и распределяют шпателем. Затем, не меняя и не стерилизуя шпатель, делают посевы поочередно в двух и более чашках. В последнем посеве на шпателе остается минимальное количество бактерий. Появляется высокая вероятность, что единичная клетка будет изолирована и на питательной среде разрастется в колонию бактерий одного вида.

Кроме этих, есть еще несколько специальных методов, применяемых для микроорганизмов, гибнущих на открытом воздухе или проводимых с помощью современной высокоточной техники. Выделенные культуры бактерий одного и того же вида тщательно консервируют (высушивают, изолируют от атмосферы, подвергают заморозке и т. д.) и хранят в соответствии с инструкциями.