V етап.

Ідентифікацію культури проводять на підставі:

1/ результатів ферментації полівуглеводного середовища;

2/ мікроскопії мікропрепаратів, пофарбованих за методом Грама;

3/ результатів “слайд аглютинації” з холерними групоспецифічними О1-, OR- та О139-сироватками та типоспецифічними сироватками Огава, Інаба, Хікоджима;

4/ результатів реакції іммобілізації з холерною О1-сироваткою;

5/ Результатів тестів для диференціації збудників холери:

а/ чутливості до бактеріофагів С ІV та Ель-Тор ІІ¹³

б/ аглютинації курячих еритроцитів¹⁴

в/ чутливості до поліміскину¹⁵

г/ гемолізу еритроцитів барана (проба Грейга)¹⁶

д/ гексамінового тесту¹⁷

е/ реакції Фогеса-Проскауера;¹⁸

6/ результатів вивчення біохімічних характеристик за Хайбергом.

Бактеріологічне дослідження закінчується вивченням чутливості збудника холери до антибактеріальних препаратів.

На підставі отриманих результатів дослідження через 30-36 годин від початку дослідження видається остаточна відповідь щодо збудника захворювання.

Експрес-методи діагностики

1. Найкращою реакцією є РІФ, яка дає можливість через 1,5-2 години виявити холерних вібріонів у досліджуваному матеріалі, а також у середовищі після підрощування у кількості 10⁶ мікробних клітин у 1мл.

2. За допомогою реакції іммобілізації вібріонів при дії холерної О1-сироватки збудника можна виявити через 15-20 хвилин при концентрації його у досліджуваному матеріалі не менше ніж 10⁵ мікробних клітин у 1мл.

На предметне скло наносять 2 краплі рідких випорожнень, блювотних мас або плівки з накопичувального середовища. Першу краплю накривають покривним скельцем (контроль), до другої додають краплю холерної О1-сироватки (1:100), перемішують і також покривають покривним скельцем. Приготовлені мікропрепарати “надавлена” крапля мікроскопіюють з використання темнопольного конденсору. Якщо у препаратах присутній холерний вібріон, то у першому мікропрепараті видно характерний рух бактерій, у другому – іммобілізація бактерій та їх аглютинація.

3. Для прискореної діагностики захворювання застосовують також чутливу реакцію непрямої гемаглютинації з використанням холерного антитільного еритроцитарного діагностикума.

4. Для швидкого та надійного виявлення холерних вібріонів у різних об‘єктах навколишнього середовища, особливо тих, що погано або зовсім не культивуються, використовують метод полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР).

Серологічні дослідження мають допоміжне значення. У сироватці крові хворих, вібріоносіїв виявляють титр вібріоцидних антитіл та антитоксинів. У хворого необхідно досліджувати парні сироватки з інтервалом у 8-10 днів (першу пробу беруть на 3-5 день захворювання).

Найбільш чутливою є реакція визначення вібріоцидних антитіл.

Титр вібриоцидних антитіл визначають, починаючи з третього дня захворювання, і їх титр максимально зростає на 10-12 день захворювання (межі титру 1:100–1:1000).

При постановці реакції спочатку ізотонічним розчином хлориду натрію титрують комплемент до титру 1:20 і розтитрований комплемент розливають у ряд пробірок по 0,9мл. Потім у першу пробірку вносять 0,1мл сироватки хворого, перемішують і послідовно переносять по 0,1мл у пробірки до титру 10^-10. У кожну пробірку додають по 0,1мл суспензії культури холерного вібріону, який містить 1-2 тисячі мікробних клітин. Одночасно ставлять контроль комплементу, сироватки та культури. Пробірки інкубують у термостаті (37ºС) 60 хвилин і роблять висіви з них на сектори агару в чашках Петрі, інкубують у термостаті 18-20 годин і підраховують кількість колоній. Титром вібріоцидних антитіл є максимальний титр сироватки, який спричинив загибель не менше 50% вібріонів у порівнянні з кількістю колоній, які виросли після висіву з пробірки контролю комплементу.

Визначення титру антитоксинів у сироватці крові хворого проводять за допомогою РНГА з холерним еритроцитарним ентеротоксичним діагностикумом (за загальною методикою). Діагностичним титром вважають титр сироватки 1:160.

Антитіла до холерогену також визначають у РІФ та за допомогою ІФА.