Методичні рекомендації по проведенню мікробіологічної діагностики холери

Бактеріоскопічне дослідження

Із досліджуваного матеріалу готують мікропрепарати, фарбують їх за методом Грама, водним фуксином Пфайффера або карболовим фуксином Циля. У мікропрепаратах збудник холери має вигляд прямих або трохи зігнутих паличок червоного кольору (грамнегативні бактерії), які розташовані між тяжами слизу у вигляді скупчень і нагадують ”табунці рибок”.

За результатами бактеріоскопічного дослідження дають орієнтовну відповідь.

Збудник холери характеризується поліморфізмом, тому у мікропрепаратах можна виявити клітини коковидної та колбоподібної форми. Це зменшує діагностичну цінність бактеріоскопічного методу. Для прискорення дослідження доцільно використати реакцію імунофлюоресценції з міченими діагностичними холерними О1- та О139-сироватками.

Бактеріологічне дослідження⁷

Дослідження матеріалу від хворих, вібріоносіїв та дослідження патологоанатомічного матеріалу проводять у 5 етапів.

І етап. Матеріал сіють у 1% пептонную воду (перше накопичувальне середовище; термін інкубації 5-6 годин), 1% лужну пептонну воду з телуритом калію⁸ (термін інкубації 12-18 годин), на лужний МПА (термін інкубації 14-16 годин) та на елективне середовище (ТСВS-агар⁹, середовище Монсура; термін інкубації 18-24 години). Посіви інкубують у термостаті (t=37ºС).

ІІ етап (через 5-6 годин від початку дослідження).

1. Вивчають характер росту бактерій у 1% пептонній воді¹⁰: на поверхні середовища утворюється голубувата плівка (при рості біовару V. cholerae cholerae) або плівка білуватого кольору (при рості біовару V. cholerae eltor). При струшуванні плівка легко руйнується і зсідає на дно у вигляді пластівців, а пептонна вода стає помірно каламутною. Плівка, утворена R-формами холерного вібріону щільна, суха, зморшкувата.

2. З матеріалу плівки готують:

а/ мікропрепарат, фарбують його за методом Грама та мікроскопіюють. Вивчають морфологічні та тинкторіальні властивості бактерії;

б/ препарат “висяча” або “надавлена” краплі, застосовують темнопольну мікроскопію для виявлення рухливості бактерій.

3. Матеріал з плівки вивчають у “слайд аглютинації” з холерними групоспецифічними О1-, OR-¹¹ та О139-сироватками для диференціації їх від холероподібних вібріонів – НАГ-вібріонів (неаглютинуючих вібріонів).

4. Матеріал поверхневої плівки сіють на лужний МПА (посів на щільне середовище роблять петлею діаметром 5-6мм).

5. Роблять пересів культури з 1% пептонної води (першого накопичувального середовища) у 1% пептонную воду (друге накопичувальне середовище): переносять 0,1-0,5мл середовища поверхневого шару у пробірку з 5-10мл середовища (результат культивування також вивчають через 5-6 годин).

За результатами дослідження видають першу попередню відповідь про виявлення холерного вібріону.

ІІІ етап (через 12-14 годин від початку дослідження).

1. Вивчають характер росту бактерій у 1% пептонній воді (другому накопичувальному середовищі) і пересівають культуру на лужний МПА.

2. Вивчають культуральні властивості бактерій на лужному МПА: збудник холери утворює круглі (2-3мм) гладенькі плоскі з голубуватим відтінком прозорі колонії з рівними краями маслянистої консистенції.

3. З матеріалом з колоній ставлять “слайд аглютинацію” з холерними групоспецифічними О1-, OR- та О139-сироватками.

4. Матеріал з колоній, характерних для збудника холери, пересівають у полівуглеводне середовище (наприклад, Кліглера, Рассела) для виділення чистої культури та її ідентифікації.

ІV етап (через18-24 години від початку дослідження).

1. Вивчають культуральні властивості бактерії на лужному МПА, ТСВS-агарі та результати росту у 1% пептонній воді. На ТСВS-агарі збудники холери утворюють великі жовті щільні колонії на фоні блакитно-зеленого кольору середовища.

2. З матеріалом з колоній на лужному МПА проводять біохімічну ідентифікацію вібріонів, використовуючи набір індикаторних папірців СІП-1¹² або ставлять холера-рот реакцію, яка допомагає виявити утворення індолу збудником холери.

3. Оксидазопозитивні колонії перевіряють у “слайд аглютинації” з холерними групоспецифічними О1-, OR- та О139-сироватками (титр сироватки 1:100) та типоспецифічними сироватками Огава, Інаба, Хікоджима (титр сироватки 1:50), з матеріалом з колоній готують мікропрепарати, фарбують їх за методом Грама для вивчення морфологічних та тинкториальних властивостей, готують препарат для люмінесцентної мікроскопії, ставлять розгорнуту реакцію аглютинації з бактеріальною суспензією (холерну аглютинуючу О1-сироватку у пробірках розтитровують до титру пептонної води, потім у кожну пробірку вносять 1-2 краплі суспензії бактерій. Результат аглютинації обраховують після 3-4 годинної інкубації у термостаті при 37ºС).

За результатами дослідження видають другу попередню відповідь про виявлення холерного вібріону.