1. Серологические методы

Лимфоцитотоксический тест (основной метод): к сывороткам против разных антигенов HLA добавляют культуру исследуемых лимфоцитов - после инкубации добавляют комплемент - лимфоциты, несущие антиген под действием комплемента разрушаются - затем к лимфоцитам добавляют краситель, окрашивающий только живые клетки. Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов.

Оценка результатов лимфоцитотоксического теста

Число погибших клеток, %	Балл	Результат
0—10	1	Отрицательный
11—20	2	Сомнительный
21—50	4	Слабо положительный
51—80	6	Положительный
81—100	8	Резко положительный

A. Zachary, G. Teresi (eds.). ASHI Laboratory Manual (2nd ed.). Lenexa. KS: American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 1990.

2. Молекулярно-генетические методы - исследование ДНК. Используются только для типирования генов HLA класса II.

а. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Метод основан на способности бактериальных эндонуклеаз расщеплять ДНК в тех участках, в которых сосредоточены специфические для определенной эндонуклеазы последовательности нуклеотидов — сайты рестрикции. Применение эндонуклеаз позволило выявить полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК, подобный полиморфизму HLA, определяемому серологически.

б. Определение специфических олигонуклеотидных последовательностей. Используют одноцепочечные олигонуклеотидные зонды полностью комплементарные уникальным последовательностям каждого известного аллеля гена HLA. Для определения неизвестного аллеля можно последовательно использовать серию зондов разной специфичности.

в. ПЦР — получения большого количества копий фрагментов ДНК с определенной нуклеотидной последовательностью.

3. Клеточные методы. После распознавания чужеродного антигена начинается пролиферация T-лимфоцитов. Этот процесс можно воспроизвести in vitro в смешанной культуре лимфоцитов, состоящей из лимфоцитов донора и реципиента. Если донор и реципиент несут разные антигены HLA класса II, в смешанной культуре отмечается пролиферация.

Выявление сенсибилизации реципиента антигенами HLA

Определение антител к антигенам HLA.

1. Коэффициент серопозитивности - отношение числа образцов лимфоцитов, вызывающих положительную реакцию, к общему числу образцов в панели, выраженное в процентах. Исследование проводят с помощью лимфоцитотоксического теста. Коэффициент серопозитивности отражает риск сверхострого отторжения трансплантата, взятого от случайного донора. Чем этот коэффициент выше, тем сложнее подобрать совместимого донора. Если коэффициент серопозитивности превышает 80%, трансплантация возможна только от донора, полностью совместимого с реципиентом по антигенам HLA.

2. Серологические методы выявляют в сыворотке реципиента следующие антитела:

а. Антитела к антигенам HLA класса I: HLA-A, HLA-B и HLA-C. Эти антигены присутствуют на поверхности лимфоцитов и моноцитов.

б. Антитела к антигенам HLA класса II: HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Эти антигены присутствуют на поверхности моноцитов и B-лимфоцитов. На поверхности не сенсибилизированных T-лимфоцитов они отсутствуют.

Проба на индивидуальную совместимость

Завершающий этап подбора донора — проведение пробы на индивидуальную совместимость. В основе пробы на индивидуальную совместимость лежит лимфоцитотоксический тест. Для этого к лимфоцитам донора добавляют сыворотку реципиента. Цель исследования — выявить любые антитела, которые могут реагировать с антигенами HLA донора и вызвать сверхострое отторжение трансплантата. Положительный лимфоцитотоксический тест свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата.