10.7. Выделение и титрование бактериофага
В ряде случаев, например, с научными, санитарно-гигиеническими целями или для постановки реакции нарастания титра фага необходимо выделить фаг или из объекта окружающей среды или из бактериальной культуры, а иногда еще и определить его количество в единице объема (этот показатель и определяется термином титр бактериофага).
А. Выделение бактериофага проводят по следующему алгоритму.
1. Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр.
2. Фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру.
3. После термостатирования проводят учет опыта.
а. Рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага.
б. Отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.
Б. Титрование бактериофага проводят или по методу Аппельмана или по методу Грациа.
1. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.
б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.
в. Посевы инкубируются в термостате.
г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага.
2. Титрованием фага по Грациа можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до одной фаговой корпускулы.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в полужидкой питательной среде.
б. К каждому разведению добавляется чувствительная культура с таким расчетом, чтобы в отсутствие бактериофага получился рост в виде газона.
в. Каждое разведение фагосодержащего материала в полужидкой среде с добавлением чувствительной культуры заливается в чашку Петри на слой плотной питательной среды, используемой в роли подложки.
г. Посевы инкубируются в термостате.
д. Низкие разведения бактериофага полностью лизируют бактерии и роста не наблюдается. По мере разведения фага появляются отдельные изолированные бляшки, каждая из которых – результат репликации одной фаговой корпускулы. Для подсчета титра бактериофага следует количество бляшек умножить на то разведение, в котором эти бляшки подсчитаны. (Рис. 10.7-1 и 10.7-2).
|
Рис. 10.7-1. Бляшки (стерильные пятна, негативные колонии) бактериофага |
|
Рис. 10.7-2. Появление изолированных бляшек по мере разведение фагосодержащего материала |
5Г. Тестовые вопросы по теме занятия
Физический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:
-использование анаэростата
удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции
совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма
Химический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:
использование анаэростата
-удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции
совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма
Биологический метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий:
использование анаэростата
удаление кислорода в замкнутом объёме с помощью химической реакции
-совместное культивирование в замкнутом объеме культур аэробного и анаэробного микроорганизма
Метод создания анаэробных условий для культивирования бактерий, который сочетает в себе физические, химические и биологические способы создания безвоздушной среды обитания микроорганизмов:
-метод Китта-Тароцци
метод Грациа
метод Аппельмана
метод Вильсона-Блера
метод Цейсслера
Первый этап культурального метода исследования:
-получение изолированного роста
накопление чистой культуры
окончательная идентификация чистой культуры
прогрев посевного материала
Второй этап культурального метода исследования:
получение изолированного роста
-накопление чистой культуры
окончательная идентификация чистой культуры
прогрев посевного материала
Третий этап культурального метода исследования:
получение изолированного роста
накопление чистой культуры
-окончательная идентификация чистой культуры
прогрев посевного материала
Предварительный этап культурального метода исследования:
получение изолированного роста
накопление чистой культуры
окончательная идентификация чистой культуры
-прогрев посевного материала
Предварительный этап культурального метода исследования применяется для выделения:
клебсиелл
кокков
энтеробактерий
-бацилл
-клостридий
На каком этапе культурального метода проводится прогрев посевного материала:
-на предварительном
на первом
на втором
на третьем
Дифференциально-диагностические среды (но не среды накопления и первичной дифференциации):
-Эндо
-Левина
-Плоскирева
Рассела
Клиглера
Олькеницкого
Среды накопления и первичной дифференциации:
Эндо
Левина
Плоскирева
-Рассела
-Клиглера
-Олькеницкого
Среды, на которых из биохимических признаков определяется лишь способность бактерий утилизировать лактозу:
-Эндо
-Левина
-Плоскирева
Рассела
Клиглера
Олькеницкого
Среды, на которых, кроме способности бактерий утилизировать лактозу, определяются и другие биохимические признаки:
Эндо
Левина
Плоскирева
-Рассела
-Клиглера
-Олькеницкого
Какая среда (какие среды) используется (используются) для изучения сахаролитической активности бактерий:
-среды Гисса
среда Китта-Тароцци
среда Вильсона-Блера
среда Цейсслера
желатин
Какая среда (какие среды) используется (используются) для выявления протеолитической активности бактерий:
среды Гисса
среда Китта-Тароцци
среда Вильсона-Блера
среда Цейсслера
-желатин
Какие среды при выделении энтеробактерий используются на первом этапе культурального метода:
-Эндо
-Левина
-Плоскирева
Рассела
Клиглера
Олькеницкого
Гисса
желатин
Какие среды при выделении энтеробактерий используются на втором этапе культурального метода:
Эндо
Левина
Плоскирева
-Рассела
-Клиглера
-Олькеницкого
Гисса
желатин
Какие среды при выделении энтеробактерий используются на третьем этапе культурального метода:
Эндо
Левина
Плоскирева
Рассела
Клиглера
Олькеницкого
-Гисса
-желатин
Бактериофаг:
-вирус, поражающий прокариотическую клетку
вирус, поражающий эукариотическую и прокариотическую клетку
особая бактерия, поражающая другие бактерии
Бактериофаг открыл:
-д’Эрелль
Пастер
Кох
Мечников
Левенгук
Структура бактериофага:
нуклеиновая кислота
-нуклеиновая кислота, окруженная белковой оболочкой
нуклеиновая кислота, окруженная клеточной мембраной
аналогична структуре бактериальной клетки
Бактериофаги, поражающие несколько видов бактерий:
-полифаги
монофаги
типовые фаги
Бактериофаги, поражающие один вид бактерий:
полифаги
-монофаги
типовые фаги
Бактериофаги, поражающие один вариант бактерий внутри вида:
полифаги
монофаги
-типовые фаги
Лизирует бактериальную клетку с выходом большого количества фаговых частиц:
-вирулентный фаг
умеренный фаг
дефектный фаг
Лизогенизирует бактериальную клетку:
вирулентный фаг
-умеренный фаг
дефектный фаг
Интегрируется в геном бактерии:
вирулентный фаг
-умеренный фаг
дефектный фаг
Полностью или частично заменять свой геном на участок генома бактериальной клетки – хозяина:
вирулентный фаг
умеренный фаг
-дефектный фаг
Методы титрования бактериофага:
метод Китта-Тароцци
-метод Грациа
-метод Аппельмана
метод Вильсона-Блера
метод Цейсслера