Анализ функциональной активности т- и в-лимфоцитов

1. Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помощью кожно-аллергической пробы, отражающей интенсивность реакций ГЗТ в отношении наиболее микробных антигенов (стрептококковых, туберкулина, дифтерийного анатоксина). Антиген вводят внутрикожно и через 48 часов измеряют диаметр инфильтрата – уплотнения, отражающий интенсивность реакции ГЗТ.

2. Для количественной оценки пролиферации Т- и В-лимфоцитов в ответ на распознавание конкретного антигена оценивают пролиферативную активность клеток в реакции бласттрансформации лимфоцитов. Взвесь лимфоцитов обрабатывают поликлональным митогеном (Т-лимфоциты – препаратом из растений семейства Бобовые, В-лимфоциты – компонентами клеток бактерий), инкубируют и добавляют ³Н-тимидин. Через 2-3 суток инкубации измеряют включенную клетками радиоактивность (³Н-тимидин включается в ДНК клеток при их активной пролиферации).

3. Функции Т-лимфоцитов оценивают по их способности продуцировать цитокины. Для этого после активации культуры Т-лимфоцитов определяют типы цитокинов и их количество в культуральной среде. Количество цитокинов определяют по их биологической активности или выявляют как антигены с помощью специфических моноклональных антител (МКАТ) и иммуноферментного анализа (ИФА).

4. Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов и изогемагглютининов в сыворотке крови.

5. Реакция торможения миграции лейкоцитов. В основе метода лежит способность лимфоцитов после повторного контакта с антигеном, к которому они ранее были сенсибилизированы, продуцировать различные лимфокины, в том числе влияющие на миграцию индикаторных клеток (гранулоцитов, моноцитов, макрофагов). Реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) ставят в капиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейкоцитов крови в присутствии и в отсутствие причинного микробного агента, после чего измеряют зоны миграции (в %) в присутствии антигена по сравнению с контролем (принятым за 100%). В случае выявления сенсибилизации к антигену наблюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100%).

Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации заболевания, развитию синдрома иммунных комплексов (нарушается функция их разрушения и выведения).

Адгезивную способность нейтрофилов измеряют по прилипанию к волокнам из нейлона. Поглотительную способность лейкоцитов измеряют по захвату ими различных частиц (микроорганизмы, частицы латекса). Метаболическую активность клеток можно оценить по интенсивности окислительного («респираторного») взрыва в фагоцитах (НСТ-тест) или с помощью хемолюминесцентного метода. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов оцениваются в тестах спонтанного и стимулированного микробными полисахаридами (продигиозаном и зимозаном) фагоцитоза, что позволяет при сравнении аналогичных показателей до и после стимуляции оценивать резервные способности клеток.

При определении поглотительной способности нейтрофилов рассчитывают фагоцитарный индекс (процент фагоцитирующих лейкоцитов) и фагоцитарное число (среднее число частиц, поглощенных одним активным фагоцитом). Метод основан на умении полиморфноядерных лейкоцитов связывать на своей поверхности, поглощать и переваривать чужеродные агенты (микробные клетки и их структуры, индиферрентные частицы). Полученные данные сравнивают с нормами (табл. 20).

Таблица 20

Интенсивность реакций фагоцитоза для человека в норме (нейтрофилы)

Показатели	Спонтанный	Стимулированный
Фагоцитарный индекс, %	62-68	80-88
Фагоцитарное число, шт	3-5	7-11
Показатель завершенности фагоцитоза, %	55-60	60-75
НСТ-тест (индекс активности нейтрофилов), %	10	40-80

Учитывая, что главным итогом фагоцитоза является разрушение микробной клетки (завершенный фагоцитоз), для оценки функциональной активности фагоцитов используют показатель завершенного фагоцитоза и интенсивность «респираторного взрыва» в клетках (продукция активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие). Завершенность фагоцитоза оценивают при культивировании лейкоцитарной взвеси с микробными клетками (время культивирования с каждым видом микроорганизмов устанавливают экспериментально) с последующим определением фагоцитарного индекса (учитывают только поглощенные нейтрофилами, но неразрушенные микробные клетки).

Интенсивность окислительного взрыва при фагоцитозе определяют при помощи НСТ-теста и хемилюминесцентным методом. Образуемые фагоцитами активные формы кислорода (супероксидный анион-радикал, перекись кислорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород, гипохлорная кислота, хлорамины и продукты перекисного окисления липидов) способны восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток осадка темно-синего формазана (учитывают долю формазан-положительных клеток в процентах). При инкубации лейкоцитов здоровых людей только с красителем доля формазан-положительных клеток обычно не превышает 10%, в присутствии индукторов окислительного взрыва (клеток микроорганизмов, бактериальных липополисахаридов и др.) может достигать 100%. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о дефектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Уровень хемилюминесценции при фагоцитозе также характеризует интенсивность «респираторного» взрыва. Метаболиты активированного кислорода, взаимодействуя с люминесцирующими посредниками (люминол, люцигенин и др.), вызывают хемилюминесценцию фагоцитов. Доказана высокая степень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом, поэтому определение хемилюминесценции лейкоцитов также используется как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу (рис. 13).

Рис. 13. Микрофотография мазка лейкоцитарной взвеси, инкубированной с микробной нагрузкой (увеличение Х100, окраска по Романовскому-Гимзе).

Лейкемоидные реакции

Преходящие, временные состояния системы крови, схожие с картиной, наблюдаемой лейкозах. Количество лейкоцитов может увеличиваться до 50-80 г/л. Кроме того появляется большое количество молодых миелоидных форм (миелоцитов, промиелоцитов, миелобластов), незрелых форм моноцитарных и лимфатических клеток.

Лейкемоидные реакции никогда не переходят в лейкоз. Имеют обратное развитие.

Наиболее частые причины лейкемоидных реакций:

• При инфекционных и паразитарных заболеваниях;

• Злокачественных новообразованиях (рак желудка, молочной железы, толстой кишки);

• Интоксикациях;

• Туберкулезе;

• Аутоагрессивных процессах;

• Аллергиях.

Различают несколько типов лейкемоидных реакций:

• Эозинофильный тип лейкемоидной реакции;

• Лейкемоидные реакции моноцитарного типа;

• Лимфоцитарный тип лейкемоидных реакций.

Таблица 21

Сравнительная оценка показателей периферической крови при лейкемоидной реакции миелоидного типа и хроническом миелолейкозе (Канская, 2004)

Показатели крови	Лейкемоидная реакция	Хронический миелолейкоз
Гемоглобин	Снижен, анемия развивается медленно	Низкий, анемия развивается быстро
Лейкоформула	Сдвиг влево менее выражен	Сдвиг до миелобластов более выражен, несоответствие созревания ядра и цитоплазмы
Базофильно-эозинофильная ассоциация	Отсутствует	Присутствует
Токсогенная зернистось нейтрофилов	В норме	Тромбоцитоз, осколки ядер мегакариоцитов
Щелочная фосфатаза	Повышена	Резко снижена