Алгоритм дії при проведенні мікробіологічної діагностики діареєгенного ешерихіозу

Бактеріологічний метод діагностики

Для посіву використовують основний матеріал – фекалії (≈5г) та додатковий матеріал – блювотні маси та промивні води шлунку (≈5мл). Фекалії емульгують у фізіологічному розчині у співвідношенні 1:10. Через кілька хвилин після осідання грубих решток 1-2 краплі рідини сіють на живильне середовище. Посів іншого матеріалу роблять таким же чином, як і випорожнень.

І етап – посів матеріалу.

1-2 краплі рідини, що досліджується, штрихоподібними рухами посіяти стерильною бактеріальною петлею або скляним шпателем на середовища Ендо та Левіна для отримання ізольованих колоній. Посіви інкубувати у термостаті при t=37°С протягом 18-24 годин.

ІІ етап – виділення чистої культури.

Вивчити культуральні властивості мікроорганізмів, що виросли на середовищах Ендо та Левіна. На середовищі Ендо E.coli утворює колонії темно-червоного кольору з металевим блиском, а на середовищі Левіна – колонії темного синьо-зеленого кольору з металевим блиском.

Приготувати тимчасові препарати з матеріалу колоній, пофарбувати їх за методом Грама та мікроскопіювати: пересвідчитися, що мікроорганізми є грамнегативними монобактеріями (дослідження не має вирішального значення для диференціації патогенних штамів E.coli від умовно-патогенних).

Для диференціації патогенних кишкових паличок від умовно-патогенних поставити реакцію аглютинації на склі матеріалу колоній (досліджують 5-10 колоній) з полівалентними ОК-сироватками. Частину колонії, що дала позитивну реакцію аглютинації, посіяти на МПА (скошений) для виділення чистої культури та на середовище Олькеницького². Посіви інкубувати у термостаті при t=37°С протягом 18-24 годин.

Якщо всі реакції аглютинації, що поставлені на склі, дали негативний результат, робиться висновок, що виділена культура не відноситься до патогенних кишкових паличок.

Ііі етап – ідентифікація виділеної чистої культури:

1/ за біохімічними властивостями: облік результатів росту E.coli на середовищах Олькеницького, Гісса та на пептонній воді.

На середовищі Олькеницького визначити характер ферментації кишковою паличкою глюкози, лактози, сахарози, здатність до утворення сірководню, наявність ферменту уреази: E.coli ферментують цукри до кислоти (відбувається зміна кольору всього середовища) та газу (спостерігаються розриви стовпчика середовища). E.coli переважно не утворює сірководень та не має ферменту уреази.

На середовищах Гісса E.coli ферментує глюкозу, лактозу, маніт, мальтозу, сахарозу (окремі штами) з утворенням кислоти та газу.

На пептонній воді E.coli утворює індол: папірець, насичений n-диметиламідобензальдегідом, червоніє та варіабельно утворює сірководень.

2/ за антигенною структурою: поставити реакції аглютинації на склі чистої культури кишкової палички з моновалентними ОК-сироватками для орієнтовного визначення серогрупи E.coli. Поставити розгорнуту реакцію аглютинації з моновалентною аглютинуючою сироваткою, яка дала позитивну реакцію аглютинацію на склі, для остаточного визначення серогрупи E.coli. Поставити на склі реакції аглютинації чистої культури кишкової палички з моновалентними Н-сироватками для визначення серовару штаму E.coli.

Для постановки РРА приготувати завісь чистої культури: в пробірку налити 2 мл фізіологічного розчину і внести одну петлю виділеної чистої культури кишкової палички. Половину приготовленої завісі в окремій пробірці прогріти при t=100°С протягом 1 години. Моновалентну аглютинуючу сироватку, з якою попередньо аглютинувала E.coli в РА на склі, розвести в двох рядах пробірках до титру, що вказаний на етикетці ампули. В кожну пробірку першого ряду внести по 2 краплі приготовленої завісі живих E.coli (для визначення К-антигену), а в другий ряд пробірок – по 2 краплі завісі E.coli після її прогрівання (для визначення О-антигену). Облік реакції проводити через 24 години після інкубації у термостаті. Реакція оцінюється як позитивна при утворенні аглютинату в обох рядах пробірок до робочого титру. Результатом РРА є визначення серогрупи штаму E.coli.

ІУ етап – вивчення чутливості E.coli до антибактеріальних препаратів методом стандартних дисків.

Чисту культуру E.coli посіяти "газоном" на МПА, розкласти стандартні диски, які насичені певними антибактеріальними препаратами (поліміксином-М, левоміцетином, гентаміцином, цефалоспорином, фторхінолоном). Після інкубації (через 24 години) за допомогою лінійки визначити зону затримки росту E.coli навколо кожного диску: для лікування може бути використаний той антибактеріальний препарат, який викликав затримку росту E.coli у діаметрі 15-25 і > мм.

Результатом бактеріологічного методу діагностики захворювання є визначення серовару штаму E.coli та вивчення його чутливості до антибактеріальних препаратів.

Додаток 2

Граф логічної структури теми:

"Мікробіологія ешерихіозів"

Бактеріологічне дослідження матеріалу

при коліентеритах, шигельозоподібних та холероподібних ешерихіозах

В ипорожнення, ректальні мазки

1 етап

Первинний посів на диференціально - діагностичні середовища Ендо або Левіна для отримання ізольованих колоній