2. Регуляція експресії генів на рівні транскрипції у прокаріот

Регуляція транскрипції у клітинах здійснюється на рівні індивідуальних генів, їх блоків і навіть цілих хромосом. Можливість керування багатьма генами, як правило, забезпечується наявністю у них спільних регуляторних послідовностей нуклеотидів, з якими взаємодіють однотипні фактори транскрипції. У відповідь на дію специфічних ефекторів такі фактори набувають здатність з високою точністю зв'язуватися з регуляторними послідовностями генів. Наслідком цього є ослаблення або посилення транскрипції (репресія або активація) відповідних генів. Три основні етапи транскрипції - ініціація, елонгація і термінація, розглянуті нами вище, використовуються бактеріальними клітинами для регуляції синтезу РНК. Те ж, мабуть, характерно і для інших живих організмів. Нижче наведені приклади регуляторних впливів на транскрипцію.

Регулювання на рівні ініціації транскрипції

Активність багатьох генів прокаріотів регулюється за допомогою білкових факторів, взаємодіючих з регуляторними ділянками промоторів генів. При цьому відбуваються як активація транскрипції генів, так і придушення зчитування генетичної інформації РНК-полімеразами. У першому випадку регуляторні білкові фактори називають активаторами, здійснюють позитивну регуляцію транскрипції, а в другому - репрессором. Регуляцію, пов'язану з придушенням транскрипції, називають негативною. Механізми, за допомогою яких активатори стимулюють ініціацію транскрипції, можуть бути розглянуті з двох точок зору - кінетичної і структурної. Оскільки активація промоторів шляхом утворення відкритих комплексів є лімітуючою стадією на шляху активації транскрипції в цілому, дію різних активаторів може бути охарактеризоване щодо зміни (збільшення) значень кінетичних параметрів реакцій, що відбуваються на різних етапах активації. Так, при дії активуючого комплексу Crp-cAMP на lac-промотор відбувається десятикратне збільшення рівноважної константи асоціації KB РНК-полімерази з промотором з утворенням закритого комплексу. Активація промотора PRM фага λ, опосередкована cI-білком (див. нижче), характеризується п'яти-десятикратним збільшенням константи швидкості kf переходу закритих комплексів у відкриті. Активуюча дію білка λ-cII на промотор рre супроводжується зміною обох вищезазначених кінетичних параметрів. Активація транскрипції може бути також опосередкована збільшенням швидкості звільнення промотора РНК-полімеразою після ініціації синтезу РНК. Багато активатори транскрипції, в тому числі і Crp-cAMP, згинають молекулу ДНК після взаємодії з нею, причому центр такого вигину знаходиться в сайті зв'язування активатора. Проте з використанням мутантних білків було встановлено, що згинання ДНК і зв'язування активаторів з ДНК як таке ще не забезпечують активацію транскрипції. У більшості випадків абсолютно необхідною умовою активації є наявність контакту між специфічними областями поверхонь молекул активатора і РНК-полімерази, часто з її α-субодиницями. Важливим наслідком освіти контактів між активаторами і холоферменту РНК-полімерази є часто спостережуваний синергізм у зв'язуванні обох білків з відповідними промоторами. При цьому мутації в сайтах зв'язування активаторів або промоторі як такому можуть запобігати активацію транскрипції шляхом зміни конформації молекули пов'язаного активатора або контактного ділянки на РНК-полімеразі. Послідовності нуклеотидів промоторних ділянок генів, з якими взаємодіють молекули репрессора, отримали назву операторів. У багатьох випадках репрессор зв'язується з оператором тільки в присутності низькомолекулярного ліганду, специфічно взаємодіє з репрессором. Такі низькомолекулярні ефектори отримали назву корепрессоров. Вони часто потрібні й для функціонування білків-активаторів транскрипції. Найпростіший механізм репресії полягає встеріческом блокуванні зв'язування РНК-полімерази з промотором. Це відбувається в тому випадку, якщо послідовності нуклеотидів місць посадки РНК-полімерази на промотор і репрессора на оператор перекриваються. Деякі бактеріальні білки-репрессора можуть робити свій негативний вплив на етапи ініціації, які відбуваються після зв'язування РНК-полімерази з промотором. Наприклад, молекули репрессора gal-оперону E. coli, зв'язатися з оператором OE і OI, центри послідовностей яких розташовані відповідно на відстанях -60,5 і +53,5 по відношенню до точки ініціації транскрипції, викликають утворення петлі ділянки ДНК, укладеного між ними, але не перешкоджають взаємодії РНК-полімерази з промотором. Вони надають свою дію на наступні етапи ініціації, що передують утворенню першого фосфодіефірних зв'язку. У тому випадку, якщо лише одна молекула репрессора зв'язується із зовнішнім оператором OE, він частково інгібує транскрипцію шляхом взаємодії з α-субодиницею РНК-полімерази. Це супроводжується зниженням рівня, але не повним припиненням синтезу РНК gal-оперону, тобто тоншим зміною рівня експресії відповідних генів. Поширеним механізмом активації транскрипції за допомогою білків-активаторів є полегшення її ініціації РНК-полімеразою після утворення контакту між ферментом і білком-активатором, пов'язаними з регуляторною областю промотора, що супроводжується конформаційними змінами РНК-полімерази. У бактерій є білки-регулятори, що мають активність як репрессора, так і активатора транскрипції. Такими "амфотерними" властивостями володіє, зокрема, репрессор cI фага λ. Білок-активатор катаболітних Оперон (Crp-білок) активує транскрипцію бактеріальних генів, продукти яких беруть участь у розщепленні (катаболізмі) різних органічних сполук (переважно цукрів), використовуваних зростаючої бактеріальною клітиною в якості джерела вуглецю. Свої властивості активатора Crp-білок набуває лише в комплексі з циклічним AMP (Сamp). Внутрішньоклітинна концентрація Сamp зростає у бактерій, що ростуть на бідних поживних середовищах, і знижується в умовах надлишку легко засвоюваних джерел вуглецю, наприклад глюкози. Тому система Crp-Сamp забезпечує включення експресії катаболітних Оперон лише на бідних поживних середовищах. Crp-білок може виступати і в ролі репрессора транскрипції генів галактозним оперона E. coli. Якщо всі гени катаболітних Оперон активуються Crp-білком у присутності Сamp, то негативна регуляція їх транскрипції відбувається індивідуально. Добре відомими прикладами такого роду є регуляції транскрипції lac-оперону E. coli під дією Lac-репрессора, а також галактозним і арабінозного Оперон специфічними білками-репрессором цих Оперон. Низькомолекулярні ефектори можуть змінювати активність РНК-полімерази не тільки опосередковано через білки-регулятори, але і безпосередньо при взаємодії з ферментом. За допомогою гуанозінтетрафосфата (ppGpp) у клітинах E. coli здійснюється координація експресії генів рибосомних РНК (рРНК) і білків. Цей незвичайний нуклеотид (відомий також під назвою "магічного плями") синтезується бактеріальними клітинами в умовах внутрішньоклітинного нестачі амінокислот, що призводить до значного зниження інтенсивності транскрипції генів рРНК і білків та одночасної стимуляції синтезу РНК Оперон, контролюючих біосинтез амінокислот. У присутності ppGpp очищена РНК-полімераза припиняє синтез рРНК з одного з двох промоторів цих Оперон, що призводить до послаблення, але не повного припинення їх транскрипції. Відомі мутації, локалізовані в гені β-субодиниці РНК-полімерази E. coli, що призводять до припинення впливу ppGpp на синтез РНК, що підтверджує наявність безпосереднього контакту між нуклеотидом і ферментом в процесі транскрипції. Деякі регуляторні елементи бактерій, що беруть участь в активації транскрипції, так само як і енхансери еукаріот, можуть розташовуватися на великій відстані (декількох сотень нуклеотидів) від промоторів, на які вони надають свою дію. У цьому випадку контакт активатора з РНК-полімеразою забезпечується завдяки випетліванію ділянки ДНК, розташованого між даними регуляторними елементами, що приводить до просторового зближення двох білків.Прямий доказ утворення таких петель на ДНК E. coli було, зокрема отримано за допомогою електронної мікроскопії для білків NtrC і NifA, що діють відповідно на промотори генів glnA і nifH. Іншим шляхом досягнення білком-активатором молекули РНК-полімерази на віддаленому промоторі (наприклад промоторі пізніх генів бактеріофага Т4) є його переміщення вздовж відрізка ДНК, що розділяє ці два регуляторних елемента. Процес такого переміщення може бути ініційований послідовностями нуклеотидів, розташованими вище або нижче промотора на відстані кількох сотень пар основ. Одним з давно обговорюються питань є необхідність зміни структури ДНК в околицях промоторів під дією білків-активаторів для активації транскрипції. У ряді випадків такі докази були отримані. Так, в mer-локусі E. coli, що забезпечує стійкістьбактеріальних клітин до іонів ртуті, зв'язування Mer-білка з регуляторним ділянкою промотора (merT) в присутності ртуті супроводжується розкручуванням спіралі ДНК в районі промотору на 50о. Це призводить до утворення правильного відстані між сайтами зв'язування активатора та промотором, так як перший розташований незвично - між нуклеотидами в положеннях -35 і -10 промотора. Без такої зміни структури ДНК зв'язавшись з ним активатор не може утворити правильного контакту з РНК-полімеразою.