Реактиви, сировина, матеріали

• Покривні і предметні скельця;

• Чашки Петрі;

• Фільтрувальний папір;

• Бактеріологічна петля;

• Бактеріологічна голка;

• Мікроскоп МБР – 1;

• Суспензія культур бактерій;

• Фуксин;

• Формалін;

• 95 % - й етанол;

• Розчин Никифорова;

• 5%-й розчин сульфатної кислоти;

• Метиленова синь;

• Карболовий фуксин Циля.

Контрольні запитання

1.Що таке посів і пересів у мікробіології?

2.Якими пристосуваннями користуються при посівах мікроорганізмів?

3.Що таке «посів уколом»?

4.Що таке накопичувальна культура?

5.Що таке чиста культура? Де застосовують чисті культури мікроорганізмів на виробництві?

6. Суть виділення чистої культури поверхневим методом.

7. Що таке предметні та покривні стекла? Для чого вони використовуються?

8.Як приготувати препарат «роздавлена крапля» ?

9.Як приготувати препарат «висяча крапля»?

10.Як приготувати фіксований препарат?

11.Що таке фіксація препарату?

12.Як пофарбувати препарат за Грамом?

13.Як готують, сушать і фіксують мазки?

14.Що таке просте та складне фарбування мікроорганізмів?

Лабораторна робота № 5

Дослідження морфології бактерій. Форма клітин

Мета роботи – вивчити морфологічні ознаки бактерії

Основні теоретичні положення

1 Морфологічні ознаки бактерій та актиноміцетів

Більшість бактерій – одноклітинні організми з розмірами від 0,5 до 10 мкм. Клітини більшості бактерій мають сферичну, циліндричну чи звивисту форму. Крім того, виявлені галузисті і нитчасті бактерії; бактерії, які утворюють простеки (вирости); бактерії у вигляді півкола (тороїди), правильної шестикутної зірки, трикутної та прямокутної форми тощо. Форма клітин визначається ригідною клітинною стінкою. Проте у деяких бактерій клітинна стінка є еластичною (спірохети, міксобактерії, флексибактерії) або й зовсім відсутня (мікоплазми, L-форми).

Сферичні бактерії – коки мають форму правильної кулі. Їх розміри знаходяться в межах 1,2-5,0 мкм. Переважно це нерухомі клітини, які не утворюють ендоспор. Вони поділяються на наступні групи.

Мікрококи в природі зустрічаються у вигляді поодиноких клітин (Micrococcus albus).

Диплококи – подвійні коки (Diplococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Azotobacter chroococcum).

Тетракоки – угруповання чотирьох коків (Tetracoccus casei, Tetracoccus mycodermatis, Рediococcus acidilactici).

Стрептококи – бактерії, які внаслідок поділу клітин у одній площині утворюють різної довжини ланцюжки (Streptococcus lactis,Streptococcus cremoris, Streptococcus mutans).

Стафілококи – скупчення коків у вигляді грон винограду (Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes).

Сарцини – коки, які діляться у трьох взаємоперпендикулярних площинах, внаслідок чого утворюються пакети з 8, 16, 32 і т.д. клітин (Sarcina ureae, Sarcina ventriculi, Sarcina flava).

Всі коки за винятком Streptococcus lactis зручно мікроскопіювати за допомогою фіксованих та забарвлених фуксином препаратів.

Рис.1. Micrococcus albus

Рис.2. Sarcina flava Рис.3. Staphylococcus aureus

Найрізноманітнішою та найчисельнішою групою бактерій є паличкоподібні (циліндричні) форми. Їх поділяють на дві групи: бактерії – нездатні до спороутворення палички (Escherichia coli, Pseudomonas denitrificans, Acetobacter aceti) і бацили – палички, які утворюють ендоспори (Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus megaterium, Clostridium pasteurianum, Clostridium tetani).

Рис.4. Lactobacillus delbrueckii Рис.5. Escherichia coli

Рис.6. Bacillus subtilis Рис.7. Bacillus megaterium

Бактерії та бацили можуть утворювати угруповання клітин у вигляді диплобактерій (диплобацил) та стрептобактерій (стрептобацил) – нитчасті форми. У деяких бактерій ланцюжки однакових клітин можуть бути вкриті спільною оболонкою (піхвою) і утворювати трихом (Thiotryx nivea, Beggiatoa alba, Beggiatoa gigantea). Нитчасті форми розповсюджені в намулах, грунті і водоймах, особливо з високим вмістом заліза. У водоймах найчастіше зустрічається залізобактерії роду Leptothrix, які оксилюють закисні форми заліза в окисні. При цьому накопичується гідроксид заліза, який надає бактеріям жовтуватобурого забарвлення.

Звивисті форми. В залежності від ступеня звивистості розрізняють вібріони, спірили і спірохети.

Вібріони – злегка вигнуті палички у вигляді коми (Vibrio cholerae, Bdellovibrio bacteriovorus, Desulfovibrio desulfuricans).

Спірили. На відміну від вібріонів їх клітини довші, товстіші, звивистіші. Спірили можуть утворювати один або кілька завитків – у вигляді літер С, S або спіралі (Rhodospirillum rubum, Spirillum volutans, Thiospira winogradskyі).

Вібріони і спірили зручно розглядати на фіксованому і зафарбованому фуксином препараті, виготовленому із гною. На такому препараті багато клітин різних видів мікроорганізмів, і серед них часто зустрічаються вигнуті форми.

Спірохети – довгі і тонкі клітини з великою кількістю малих, але крутих завитків, що зумовлене відсутністю твердої стінки і специфічним характером руху. Довжина спірохет перевищує товщину в 5200 раз (Treponema pallidum, Leptospira dentium). Для знайомства з цією формою бактерій можна приготувати фіксований фарбований препарат із зубного нальоту. Зубні спірохети надзвичайно тонкі, майже волосоподібні.

Міксобактерії – група бактерій, що стоять на вищому щаблі розвитку, ніж описані вище. Вегетативні клітини мають паличкоподібну форму із загостреними чи округлими кінцями. В процесі старіння вони вкорочуються і переходять в мікроспори, які потім з’єднуються слизом і утворюють первинні і вторинні цисти. З останніх пізніше формуються плодові тіла.

Актиноміцети. Ця група мікроорганізмів займає проміжне положення між бактеріями і грибами. Вони одноклітинні, як бактерії, і утворюють міцелій, як гриби (Actinomyces lividans, Actinomyces albus).

Діаметр ниток у цих мікроорганізмів дуже малий, як у бактерій (0,50,8 мкм), гіфи міцелію довгі і галузисті, як у грибів. З грибами їх об’єднує також здатність розмножуватися спорами.

На живильних середовищах актиноміцети утворюють пухнасті, мучнисті, переважно щільні колонії, що зростаються із субстратом, інколи вони мають характерний землистий запах. Точніше, запах грунту зумовлений актиноміцетами. Міцелій актиноміцетів на живильних середовищах диференційований: одна частина занурена в субстрат (субстратний міцелій), інша знаходиться над субстратом (повітряний міцелій). Багато представників актиноміцетів продукують пігменти, тому їх повітряний міцелій і особливо колонії мають різноманітні відтінки. Актиноміцети, дифундуючи в поживне середовище пігменти, забарвлюють його у відповідний колір. Багато спільного з актиноміцетами мають нокардія, або проактиноміцети, і мікобактерії, пов’язані з ними генетично.

а б в

Рис.8. Актиноміцети:

а-корінебактерії; б – мікобактерії; в – стрептоміцети.

Нокардіа (проактинаміцети). Це форми мікроорганізмів, перехідні між актиноміцетами і мікобактеріями (Nocardia rugosa). Повітряний міцелій у них відсутній або слабко розвинений. На живильних середовищах розвиваються колонії тістоподібної (м’якої) консистенції. Кольори їх так само різноманітні як і у справжніх актиноміцетів. Молоді проактиноміцети утворюють міцелій, який швидко починає септуватися (в нитках утворюються перетинки) і розчленовуватися на паличкоподібні фрагменти, потім вони переходять або у вкорочені палички, або частіше в коки.

Мікобактерії. Це найбільш низько організовані актиноміцети (Mycobacterium luteum, Mycobacterium tuberculosis). Справжнього міцелію не утворюють. Колонії тістоподібної консистенції, продукують пігмент. У молодому віці формують палички неправильної форми з нерівним контуром (зіркоподібні, іноді досить довгі, з боковими відростками). В старих культурах галузисті палички часто розпадаються спочатку на коротші палички, а потім на коки.

2. Культуральні ознаки бактерій

3 метою ідентифікації мікроорганізмів проводять посів чистих культур на щільні середовища у чашки Петрі і на скошене ага­ризоване середовище в пробірки. При рості на чашках Петрі розрізняють поверхневі, глибинні колонії. Вивчають і описують особливості поверхневих колоній, що розміщені ізольовано одна від одної, і відмічають такі ознаки:

1. форма колоній - кругла, овальна і т.д. (рис. 9);

б

Рис. 9. Форми колоній:

а - кругла; 6 - кругла з фістончастим краєм; в - кругла з валиком по краю; г та д - ризоїдна; е - з ризоїдним краєм; є - амебоподібна; ж - ниткоподібна; з - складчаста; u - неправильна; і - концентрична; к - складна

2) розміри - діаметр вимірюють лінійкою і виражають в міліметрах: дрібні - 1-2, середні - 2-4, крупні - більше 4, найдрібніші - менше 1 мм;

3) колір колоній і субстрату під колоніями (від білого до чорного);

4) поверхня - гладка, шорстка, складчаста, бугриста, блис­куча, матова, борошниста, флуоресцируюча, волога, суха;

5. прозорість - прозора, напівпрозора, непрозора;

5. край колонії - встановлюють при малому збільшенні мікроскопа або за допомогою лупи (рис. 10);

Рис. 10. Край колоній:

а – гладкий; б – хвилястий; в – зубчастий; г – лопатевий; д – неправильний; е – вієподібний; є – ниткоподібний; ж – ворсинчастий; з – гілкоподібний.

7) структура колонії (встановлюють при малому збільшені мікроскопа) - однорідна, дрібнозерниста, волокниста;

8) профіль - плоский, вигнутий, каплеподібний, конусо­подібний та ін.

Рис. 11. Профіль колоній:

а – вигнутий; б – кратероподібний; в – бугристий; г – вростаючий в агар; д – плоский; е – випуклий; є – каплеподібний; ж – конусоподібний.

Колонії, що відрізняються хоча б однією із зовнішніх ознак, варто розглядати як різні типи. Кожен вид бактерій має певний тип колонії, тому за кількістю типів колоній в чашках Петрі можна судити орієнтовно про різноманітність видового складу бактеріальної мікрофлори досліджуваних харчових продуктів.

Завдання на виконання

1. Приготувати препарати «роздавлена крапля» різних видів бактерій: мікрококів, стрептококів, стафілококів, сарцин. Вивчити під мікроскопом форму і розташування клітин. Деякі бактерії при­готувати у вигляді мазків, висушити, зафіксувати, зафарбувати розбавленим фуксином і розглянути з імерсією.

2. Приготувати препарати «роздавлена крапля»: молочнокислих бактерій, кишкової та сінної паличок. Звернути увагу на характер руху, форму і з'єднання клітин, характер спороутворення, місцезнаходження спор у клітинах бацил. Замалювати.

3. Провести фарбування методом негативного контрасту капсул у бактерій Leucoпostoc mesenteroides.

4. Провести одним із методів фарбування спор у бактерій роду Bacillius.

5. Зафарбувати, за Грамом, на одному предметному склі молочнокислі бактерії, кишкову паличку та їх суміш.

6. Вивчити і описати колонії бактерій на щільному середовищі.