Робота №3 дослідження фарбованих препаратів. Виявлення структур мікробних клітин за допомогою простого фарбування

Для фарбування мікробних клітин використовують кристалічні або аморфні порошки (анілінові барвники). Це – органічні речовини, які за властивостями розділяють на 2 групи – кислі та основні барвники (табл.3).

Таблиця 3. Основні властивості барвників

Ознаки барвників	Тип барвника
	Кислотні	Основні
Взаємодія з речовинами мікробних клітин	Найкраще взаємодіють з речовинами основної природи (цитоплазматичні компоненти клітини)	Найкраще взаємодіють з речовинами кислої природи (ядерна речовина клітини)
Назви барвників, колір їх розчинів	Еозин, еритрозин, кислий фуксин (червоні, рожеві) Нігрозин (чорні) Конго, флуоресцин, пікринова кислота (жовті).	Генціан фіолетовий, кристалічний фіолетовий, гематоксилин, тіонін (фіолетові). Метиленовий синій, вікторія блау (сині). Основний фуксин, сафранін, нейтральний червоний (червоні). Янус зелений, метиленовий зелений, бриліантовий зелений (зелені). Везувін, хризоїдін (коричневі). Індулін (чорні).

Вибір барвника (барвників) залежить від мети мікроскопії, оскільки в мікробних клітинах обов’язково присутні речовини і кислої, і основної природи. Барвники використовують у вигляді водних і неводних розчинів. В неводних розчинах розчинником є спирт, формалін, фенол та ін. речовини. Водні розчини – нестійкі, фарбують повільно і не всі мікробні клітини. Тому при проведенні фарбування найчастіше використовують неводні розчини барвників або фарбують мікробні клітини з підігріванням розчину, нанесеного на скло.

Барвниками, які постійно потрібні в мікробіологічній лабораторії, є такі: фуксин Циля, фуксин Пфейфера, метиленовий синій за Лефлером, набір реактивів для фарбування за Грамом та фарба Романовського.

Методика виготовлення фіксованих препаратів.

Всі мікробні препарати перед фарбуванням обов’язково фіксують. В фіксованих препаратах зручно вивчати морфологічні властивості прокаріотів, особливо патогенних. Причина в тому, що після фіксації:

• мікроби надійно закріплюються на склі за рахунок коагуляції білків;

• вбиті клітини патогенних мікробів не здатні викликати хворобу;

• мертві мікробні клітини краще сприймають фарби.

Фіксація отриманого мазка здійснюється декількома способами (рис.6).

Способи фіксації

Термічна фіксація	Хімічна фіксація (сполуки хрому, формалін, етиловий та метиловий спірти, ефір, ацетон, осмієва кислота)
Предметне скло декілька разів (мазком доверху) проноситься крізь полум’я пальника	Фіксуючий розчин наноситься піпеткою на поверхню мазка	Скло з мазком занурюють в кювету з розчином
	Через 2-5 хвилин розчин змивають Н2О, надлишок її видаляють фільтрувальним папером, скло підсушують на повітрі.

Рис. 6. Способи фіксації мазків.

Крім того, при виконанні певних методик, фіксація мазка-відбитка, мазка крові чи суспензії патматеріалу, може здійснюватись висушуванням на повітрі.

В залежності від кількості використаних для фарбування розчинів барвників розрізняють прості і складні методи фарбування (табл.5).

Таблиця 5. Загальна характеристика простих і складних методів фарбування

Характеристика методу	Назва методу фарбування
	Простий	Складний
Кількість розчинів барвників	Використовується тільки один фарбуючий розчин.	Використовується декілька фарбуючих розчинів, спирти, кислоти та інші речовини.
Локалізація барвника	Зафарбовується вся клітина	Зафарбовуються певні частини клітини.
Призначення методу	Використовується для вивчення форми і розмірів клітини	Використовується для вивчення органоїдів та окремих структур клітини.

Методика фарбування простим методом

Прості методи фарбування для ідентифікації мікроорганізмів використовують в певних обставинах:

• біологічні особливості даного мікроорганізму не дозволяють використовувати загальноприйняті складні методи фарбування (мікоплазмози);

• при взаємодії з одним барвником клітина мікроба фарбується нерівномірно, внаслідок чого при мікроскопії спостерігаються спеціфічні ознаки даної клітини, такі як біполярне або зернисте фарбування.

Методика фарбування простим методом здійснюється за такою схемою:

1. Фіксований препарат кладуть на містки, розміщені на стінках кювети або кристалізатора.

2. Заливають мазок фарбуючим розчином на 1-3 хв.

Барвник можна також наливати на мазок, вкритий фільтрувальним папером. Якщо барвник підсихає, на мазок наливають нові порції розчину.

Також можна використовувати фільтрувальний папір, просочений розчином барвника (економія реактиву). В такому випадку на пофабований папір, накладений на мазок, наливають воду. Через декілька хвилин фільтрувальний папір знімають.

3. Препарат промивають водою (при потребі)

4. Фарбований препарат висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальним папером.

В правильно виготовленому препараті поле зору прозоре і чисте, а пофарбовані – тільки клітини мікроорганізмів.

Фарбований препарат після просушування можна роздивлятись під мікроскопом через повітря або через масло (масляна імерсія). В останньому випадку на висушений фарбований препарат наноситься крапля кедрової олії і мікроби роздивляються з допомогою об’єктиву для масляної імерсії (з чорною смугою).

Результат:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

РОБОТА №4.

Виявлення будови клітинної стінки мікроорганізмів.

Класичний спосіб фарбування за Грамом та його модифікації.

Фарбування за Грамом – це один з найважливіших методів ідентифікації мікроорганізмів. Метод запропоновано Крістианом Грамом в 1884 році. Важливість данної методики для диференціації бактерій вперше було проголошено Емілем Ру в 1886 році. В наш час для фарбування мікроорганізмів багатьох морфологічних груп використовують і класичний варіант, і його різноманітні модифікації (табл. 6,7)

Диференціацію грампозитивних та грамнегативних бактерій можна проводити за допомогою КОН. В такому випадку на предметне скло з 2 краплями 3% КОН наносять мікробну культуру. Перемішують впродовж 5-10 секунд. Потім петлю опускають в краплю і піднімають вгору:

• грамнегативна: за петлею тягнеться тяж 0,5-2 см;

• грампозитивна: слизу не утворюють.

Принцип методу Грама:

• мікробну клітину зафарбовують основним аніліновим барвником фіолетового або – рідше – зеленого чи синього кольорів;

• проводиться обробка протравою, внаслідок чого утворюється потрійний комплекс барвник + протрава+ речовини клітини. Це з’єднання стійке у грампозитивних бактерій і нестійке – у грам негативних;

• короткочасна обробка препарату знебарвлювачем (спирт, ацетон, ксилол або їх суміші). Потім знебарвлюючу речовину видаляють з водою.

• препарат зафарбовують контрастним (червоним) барвником;

Табл. 6. Розчини для фарбування за Грамом.

Назва методу, модифікації	Спосіб фіксації	Розчини для фарбування *
		Кольорові розчини	Розчин для знебарвлення
Класичний метод Грама	Мазок фіксується жаром	Генціан фіолетовий (ГФ), розчин Люголя (РЛ), фуксин (Ф)	95%-ий етиловий спирт
Модифікація Синьова	-“-	Генціан фіолетовий на фільтрувальних папірцях (ГФ), розчин Люголя (РЛ), Фуксин (Ф)	95%-ий етиловий спирт
Модифікація Ніколля	-“-	Генціан фіолетовий (ГФ), розчин Люголя (РЛ), Фуксин (Ф)	Суміш ацетону та 95%-го етилового спирту
Модифікація Бьорка	-“-	Кристалічний фіолетовий (КФ), 1% Na2CO3, йодна протрава за Бурке, сафранін (С).	Суміш ацетону та 95%-го етилового спирту

Табл.7. Методики проведення фарбування за Грамом

№	Назва модифікації	Стадії фарбування*
1	Класичний метод Грама	ГФ (1-2 хв.); РЛ (1 хв); Змити Н2О; 3. Спирт (0,5 –1,0 хв); Змити Н2О; 4. Ф (1-2 хв.); Змити Н2О.
2	Модифікація Синьова	1. Папірці, накладені на мазок змочити водою (2хв); 2. РЛ (1 хв); Змити Н2О; 3. Спирт (0,5 хв); Змити Н2О; 4. Ф (1-2 хв.); Змити Н2О.

*Примітка. ГФ – генціанфіолетовий; КФ – кристалічний фіолетовий; РЛ- розчин Люголя, Ф– розведений карболовий фуксин Циля, С- сафранін.

Після здійснення фарбування грампозитивні мікроорганізми фарбуються у фіолетовий (у методі Калини – у чорно-фіолетовий або зелений), а грампозитивні – у червоний колір.