51. Рекомбинация: гомологический кроссинговер, сайтспецифическая рекомбинация, транспозиции. Доказательство механизма общей рекомбинации по схеме «разрыв-воссоединение».

Генетическая рекомбинация подразумевает несколько типов перераспределения наследственных факторов: 1. Рекомбинация хромосомных и нехромосомных генов. Примером в данном случае может служить рекомбинация ядерных и неядерных генов, происходящая в результате гетерогамии у эукариотических организмов, а также перераспределение «хромосомы» и нехромосомных элементов типа плазмид и эписом у бактерий. 2. Рекомбинация целых негомологичных хромосом. 3. Рекомбинация участков хромосом или иных генофоров, представленных непрерывными молекулами ДНК. Этот тип рекомбинации принято подразделять на три подтипа. Регулярная, или общая, рекомбинация, представляющая собой кроссинговер, т. е. обмен гомологичными участками в различных точках гомологичных хромосом, приводящий к появлению нового сочетания сцепленных генов. Это, как правило, и подразумевают под словом рекомбинация, неоправданно сужая значение термина. В отличие от общей рекомбинации, сайт-специфическая рекомбинация происходит под контролем ферментов, опознающих специфические последовательности нуклеотидов, присутствующие на одной или двух рекомбинирующих молекулах. С помощью этого типа рекомбинации бактериальные вирусы и мобильные элементы перемещаются по геному. Сайт-специфическая рекомбинация была открыта в результате исследований механизма перемещения бактериофага А по хромосоме Е.coli. В интегрированном состоянии вирус внедрен в бактериальную хромосому и реплицируется как часть ДНК клетки-хозяина. Когда вирус проникает в клетку, на матрице вирусного гена синтезируется фермент А-интеграза. Этот фермент и катализирует процесс рекомбинации, начинающийся тогда, когда несколько молекул белка интегразы плотно связываются со специфическими последовательностями на кольцевой хромосоме фага. Получившийся ДНК-белковый комплекс теперь связывается со сходными, но не идентичными последовательностями на бактериальной хромосоме, сближая тем самым бактериальную и фаговую хромосомы. Затем интеграза делает надрезы в молекулах ДНК, формируя маленький участок сочленения гетеродуплекса. Интеграза напоминает ДНК-топоизомеразу в том отношении, что она формирует ковалентную связь с ДНК в тех же местах, где и разрывает. Тот же самый механизм сайт-специфической рекомбинации приходит в действие, только в обратном направлении, когда фаг  вырезается из сайта интеграции. Иногда в результате мейоза получаются три копии материнского аллеля и только одна копия отцовского, что свидетельствует об изменении одной копии отцовского аллеля в материнский. Это явление называется генной конверсией. Оно часто происходит в связи с событиями общей рекомбинации и репарации ДНК. Незаконная, или неправильная, рекомбинация, включающая негомологичные обмены, т. е. транслокации, инверсии, а также случаи неравного кроссинговера. Современные представления о механизме кроссинговера восходят к представлениям школы Т. Моргана, согласно которым рекомбинация сцепленных генов заключается в разрыве гомологичных хроматид с последующим реципрокным соединением их в новом сочетании (гипотеза разрыв — слияние). В 1930 г. Х. Винклер выдвинул гипотезу конверсии, согласно которой в гетерозиготе могут происходить направленные превращения одного аллеля в другой по типу:В результате такого процесса при гаметогенезе образуются все четыре типа гамет, наблюдаемые при расщеплении дигетерозиготы. Еще одна гипотеза, пытавшаяся объяснить появление рекомбинантных потомков у дигетерозигот по сцепленным генам, предложена в 1931 г. Дж. Беллингом. Согласно ей при воспроизведении хромосом в первую очередь удваиваются хромомеры, а затем происходит удвоение хромонем, которые могут соединить дочерние хромомеры в прежней или в рекомбинантной последовательности. Гипотеза Дж. Беллинга была оставлена, как и гипотеза Х. Винклера, и возрождена позже в модифицированной форме для объяснения тех случаев, когда в расщеплении дигетерозиготы появляется только один из двух реципрокных рекомбинантов. В частности, при изучении рекомбинации у бактериофагов оказалось, что некоторые клетки Е. coli, совместно инфицированные двумя генетически различными частицами одного и того же бактериофага, продуцируют лишь один из реципрокных рекомбинантных классов. Объяснение этого явления заключалось в том, что при размножении бактериофага редупликация ДНК может происходить частично по матрице одного, а частично по матрице другого фага. Такой гипотетический механизм, , назван копированием со сменой матриц. В соответствии с этой гипотезой синтез ДНК должен происходить не по полуконсервативному, а по консервативному типу, что противоречит механизму редупликации, который был доказан в экспериментах М. Мезельсона и Ф. Сталя. Гомологичная рекомбинация происходит между двумя дуплексными молекулами ДНК. Следует подчеркнуть, что ферменты, участвующие в этом процессе, могут использовать в качестве субстрата любую пару гомологичных последовательностей. Гомологичные хромосомы притягиваются друг к другу, конъюгируют в одном или более районе, формируя биваленты. Когда процесс спаривания хромосом завершен, хромосомы соединяются латерально за счет структуры, называемой синаптонемальным комплексом. Рекомбинация между хромосомами подразумевает физический обмен частями, происходящий по принципу «разрыв и воссоединение», в ходе которых две несестринские хроматиды рвутся и затем воссоединяются. Когда хромосомы начинают расходиться, их контакты между собой остаются в виде так называемых хиазм. Традиционно считается, что хиазмы представляют собой отражение существования кроссинговера, хотя формальных доказательств этой связи до сих пор не получено. первым шагом к началу рекомбинации ДНК является сближение двух дуплексных молекул ДНК. Существует много доказательств того, что даже единственной бреши только в одной цепи молекулы ДНК достаточно для инициации общей рекомбинации. Химические препараты или облучение, приводящие к образованию однонитчатых брешей, будут стимулировать рекомбинацию. Первым шагом в синапсисе является спаривание комплементарных последовательностей нуклеотидов. В результате образуется трехцепочечная структура. После этого короткий участок, в котором нити из двух различных молекул начинали спариваться, увеличивается из-за «миграции ветви» . «Миграция ветви» может происходить в любой точке, где две одиночные цепи ДНК, имеющие одинаковые последовательности, конкурируют за возможность спариваться с одной и той же комплементарной цепью. Неспаренный участок одной из одиночных цепей заменяется спаренным районом другой, двигая точку ветвления. Спонтанное движение ветви равновероятно в любом направлении. После этого у большинства изученных организмов наступает стадия формирования перекрестного обмена цепей, или структур Холлидея В этих структурах две гомологичные молекулы ДНК, которые раньше были спарены, теперь удерживаются вместе за счет сформировавшихся обменов между двумя из четырех цепей: по одной из каждой молекулы ДНК. Структура Холлидея имеет две особенности: 1) точка обмена между цепями может быстро мигрировать вперед и назад; 2) она состоит из двух пар цепей — одна пара пересекающихся и одна пара непересекающихся. Для того чтобы восстановить две раздельные спирали ДНК и таким образом закончить процесс спаривания молекул, две пересекающиеся цепи должны быть разрезаны. Если они разрезаны до изомеризации, две исходные спирали отделяются одна от другой почти неизмененными. Если пересекающиеся нити разрезаны после изомеризации, одна секция каждой из исходных спиралей ДНК соединяется с секцией другой молекулы, другими словами, две спирали ДНК испытывают кроссинговер.

52. Генетический контроль мутационного процесса. Связь мутабильности с функциями аппарата репликации. Механизмы спонтанного мутагенеза, гены мутаторы и антимутаторы. Механизмы действия аналогов оснований азотистой кислоты, акридиновых красителей, алкилирующих агентов.

Мутации возникают не мгновенно. Вначале под воздействием мутагенов возникает предмутационное состояние клетки. Различные репарационные системы стремятся устранить это состояние, и тогда мутация не реализуется. Основу репарационных систем составляют различные ферменты, закодированные в генотипе клетки (организма). Таким образом, мутагенез находится под генетическим контролем клетки; это – не физико-химический, а биологический процесс. Напомним, что гены всех без исключения организмов могут находиться в трех функциональных состояниях: неактивном (репрессия), когда обе цепи ДНК образуют двойную спираль, как бы защищенную от внешних воздействий, особенно у эукариот, молекулами специальных белков, так что ген молчит; активном (дерепрессия), когда белковая защита снята, цепи ДНК раскручены и на одной из них идет синтез молекул информационной РНК; и в состоянии репликации , когда двойная спираль ДНК раскручивается и на обеих цепях идет синтез ДНК-копий. Регулировать функциональное состояние тех или иных генов удается, меняя условия культивирования клеток. Еще в 60-е годы обнаружилось, что если синхронизировать деление бактерий и в разные сроки кратковременно облучать их ультрафиолетовыми лучами, то по мере репликации ДНК мутационный спектр меняется -- чаще мутируются то одни, то другие гены. Измененная мутабильность как бы скользит по молекуле ДНК, совпадая с точкой репликации . Явление это, указывающее на связь индуцированной мутабильности гена с его функциональным состоянием, использовали для картирования хромосом некоторых бактерий. Особенности действия химических мутагенов. К химическим мутагенам относятся самые разнообразные вещества. Рассмотрим мутагенное действие некоторых из них. Алкилирующие агенты. Вызывают алкилирование ДНК (например, метилирование, этилирование и т.д.). В результате при репликации ДНК нарушается принцип комплементарности, и происходит замена нуклеотидных пар: ГЦ > АТ; ГЦ > ЦГ; ГЦ > ТА Некоторые из алкилирующих агентов в природе не встречаются, их не распознают ферменты защитных систем. Такие вещества называются супермутагенами (например, N-метил-N-нитрозомочевина). Супермутагены применяются в селекции растений для получения индуцированных мутаций; их используют также как стимуляторы роста (в сверхмалых концентрациях). Гидроксиламин. Избирательно аминирует цитозин, что также нарушает принцип комплементарности при репликации ДНК. В результате происходит замена ГЦ > АТ. Нитриты. Осуществляют окислительное дезаминирование гуанина, аденина, цитозина. Также нарушается принцип комплементарности при репликации ДНК. В результате происходит замена АТ > ГЦ. Аналоги оснований. Это вещества, сходные с «обычными» азотистыми основаниями. Однако они способны образовывать комплементарные пары с разными «нормальными» основаниями. Например, при репликации ДНК напротив гуанина вместо цитозина достраивается 5-бромурацил (аналог тимина). В дальнейшем напротив 5-бромурацила достраивается аденин, а напротив аденина – обычный тимин. Этот же процесс может идти и в противоположную сторону. В результате происходят замены: ГЦ > АТ или АТ > ГЦ. Существует множество иных химических факторов, обладающих мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием. Например, ионы тяжелых металлов, связываясь с ферментами репликации, репарации и рекомбинации, снижают их ферментативную активность. Таким образом, не являясь собственно мутагенами, ионы тяжелых металлов способствуют появлению мутаций. Кроме того, нужно учесть, что воздействие совершенно разных мутагенов может приводить к сходным результатам. Спонтанные мутации – мутации, возникающие при нормальных условиях жизни. Спонтанный процесс зависит от внутренних и внешних факторов. Метод учета спонтанных доминантных мутаций основана том, что в редких случаях у 1 из детей появится доминантный признак, отсутствующий у обоих родит. Это должно свидетельствовать о возникновении спонтанной мутации. Частоту возникновения в генеративных тканях чел спонтанных рецессивных мут рассчитал Холдейн (эта величина равна от 1*10^-5 до 5*10^-5 за поколение). Курт Браун предложил пряиой метод оценки спонтанных генных, хромосомных и геномных мут. Он основан на изучении популяционной выборки новорожденных, частота мут рассчитывается m=число спонтанных случаев проявления данной аномалии / 2*число обследованных инвалидов. Средняя частота спонтанного возникновения мутаций в структурных локусах человека колеблется в пределах от  10-5 до 10- 6 на одну гамету за каждое поколение. Эта величина значительно варьирует для разных генов, меняясь в пределах от 10-4 для высокомутабильных локусов до  10-11 в наиболее устойчивых частях генома. Эти различия зависят от многих факторов и, в первую очередь, от характера мутационного повреждения, от механизма возникновения мутации и локализации нарушения. Большое значение имеет сам ген, протяженность его кодирующих областей и те функции, которые выполняют контролируемые им молекулы в обеспечении жизнедеятельности клеток и всего организма в целом. Так, например, нарушение работы генов, продукция которых необходима на ранних стадиях эмбриогенеза, может приводить к гибели плода. Такие мутации трудны для диагностики, и в практической медицине мы чаще всего имеем дело только с теми мутациями, которые не проявляют летального эффекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Однако не исключено, что ранние эмбриональные летали составляют немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции.

53. Понятие о мутагенных индуцибельных путях репарации: УФ-мутагенез. Мутагенез, опосредованный через процессы рекомбинации. Механизмы автономной нестабильности генома, роль мобильных генетических элементов (МГЭ).

Деятельность внутриклеточных систем репарации, биологической ролью которых является устранение повреждений структуры ДНК, возникающих под влиянием разнообразных агентов. Именно деятельность этих систем ограничивает реализацию механизмов повреждения клетки под действием не только УФ-излучения, но и радиации и химических мутагенов. Однако, первый из открытых механизмов репарации – фотореактивация – полностью направлен против димеров пиримидинов – основных повреждений, индуцированных УФ-радиацией в ДНК. Фотореактивация, как и репарация в целом, это ферментативный процесс. Фермент ДНК – фотолиаза в темноте перемещается вдоль молекулы ДНК, отыскивает димер и фиксируется около него. При облучении сине-фиолетовым светом или действии ближнего УФ-света фотолиаза использует энергию этого света и восстанавливает исходную структуру ДНК, мономеризуя димеры. Следовательно, фотореактивация – это безошибочно функционирующая высокоспецифичная система, устраняющая лишь один, но важнейший, фотопродукт – циклобутановые димеры пиримидинов. Поэтому ослабление любого биологического эффекта УФ-излучения при последующем освещении видимым светом рассматривается как доказательство участия в этом эффекте димеров как непосредственных продуктов воздействия УФ-излучения. Другие системы репарации, имеющиеся в клетке, менее специфичны, чем фотореактация, не нуждаются в свете и, наряду с димерами, способны устранять и другие изменения структуры ДНК. Существование репаративных систем обеспечивает генетическую стабильность ДНК и представляет собой важнейший механизм относительной стабильности органических видов. Определенные гены могут быть мутагенизированы с помощью гомологичной рекомбинации для того, чтобы наблюдать либо эффект инактивации данного гена, либо эффект небольших изменений в нуклеотидной последовательности ДНК данного гена. Гомологичная рекомбинация в результате одиночного кроссовера внутри гена инактивирует ген только в том случае, если рекомбинирующий фрагмент не содержит ни начала, ни конца транскрипционной единицы. Для получения мутации с более протяженным фрагментом требуется реципрокная двойная рекомбинация. Этот подход позволил охарактеризовать функции многих цианобактериальных генов. Поскольку фенотип транспозонного мутанта может быть результатом комбинированного эффекта спонтанной мутации где-нибудь в геноме и устойчивости к антибиотику, привнесенной транспозоном, обычно реконструируют такие мутанты с помощью гомологичной рекомбинации, чтобы проверить, действительно ли обусловлен мутантный фенотип только инсерцией транспозона в данный ген. Двойная рекомбинация в одних штаммах цианобактерий происходит чаще, в других - реже. Одним из успешных способов селекции двойных рекомбинантов, например, в Anabaena 7120 может послужить использование гена sacB. Присутствие гена sacB при высокой концентрации сахарозы в твердой среде летально для клеток. Введение мутантного аллеля в результате одиночного кроссинговера и затем использование sacB для селекции одной из двух полученных копий вводимого аллеля, позволяет заменить аллель дикого типа мутантным аллелем без введения в клетку гена устойчивости к антибиотику. Такой подход может оказаться очень удобным, если, например, нужно получить штамм, который будет активно использоваться (например, если нужно инактивировать ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции), а ген, определяющий устойчивость к антибиотику, может быть включен в будущие плазмидные векторы, которые будут работать в данном штамме. Целые гены могут быть делетированы, и рекомбинантные формы исходного гена затем могут быть введены в клетку для изучения, например, влияния одиночных или множественных аминокислотных замен на функцию белка, кодируемого данным геном. Транспозиционная активность МГЭ является основной причиной возникновения спонтанных мутаций. МГЭ имеют определенную структурную организацию, благодаря которой могут перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомами. МГЭ имеют способность увеличивать число копий в геноме хозяина, вызывать мутации, встраиваясь в гены или окрестности генов, служить причиной хромосомных перестроек, влиять на фертильность особей и даже приводить организм к гибели. Способны изменять – как понижать, так и повышать – уровень активности близлежащих генов. В их структуре есть большое количество регуляторных сайтов и сигнальных последовательностей, а это означает, что МГЭ могут очень интенсивно воздействовать на работу гена, не разрушая сам ген. За исключением дрозофилы, активность мобильных элементов низка в малых геномах, в которых кодирующие гены составляют заметную его часть. В больших же по размеру геномах с более активными элементами только малая доля генома будет менее чувствительна к повреждающим инсерциям. Здесь следует подчеркнуть, что в обоих случаях клетка хозяина контролирует мобильность генетических элементов. Известно два таких механизма контроля: косупрессия, обычно опосредуемая малыми интерферирующими РНК (siRNA), и метилирование. При косупрессии подавляется экпрессия вновь встроенных трансгенов и их эндогенных гомологов. Некоторые МГЭ обладают способностью вызывать гибридный дисгенез. Гибридный дисгенез проявляется у потомства в виде повышенной частоты генных мутаций, хромосомных аббераций и нерасхождения хромосом, явления рекомбинации у самцов, а также стерильности гибридов.

54. Регуляция транскриции на уровне промотора, функции РНК-полимеразы. Принципы негативного и позитивного контроля. Системная регуляция; роль циклической АМФ и гуанозинтрифосфата. Оперонные системы регуляции (теория Жакоба и Моно). Генетический анализ лактозного оперона. Регуляция транскрипции на уровне терминации на примере триптофанового оперона.

РНК-полимераза – это фермент, который считывает ген. инф. с ДНК и синтезирует матричную РНК. В РНК-полимеразе есть ко-фактор – белок, который распознает промотор и помогает РНК-полимеразе на него сесть и начать транскрипцию. Т. о. переключается работа больших групп генов, это такая системная регуляция. Клетка переключается с одной жизненной программы на другую. Очень большую роль во всех этих процессах играет циклический аденазинмонофосфат (цАМФ). Он – типичный регулятор внутриклеточного метаболизма. Такая система изменения активности аденилатциклазы и, соот-о, конц-ии цикл. АМФ в клетке, работают не только у бактерий, но и у оч. многих орг-в, в том числе у чел. Ч\з аденилатциклазу, регулируя ее активность, действуют некоторые гормоны. Меняя концентрацию циклического АМФ, эти гормоны влияют на внутриклеточные процессы. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функц-х единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза специфических белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках мех-м регул. синтеза белка вероятно более сложный. У бактерий доказана индукция ферментов (т. е. синтез ферментов de novo) при добавлении в пит. ср. субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны. Согласно теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бак. уч-т по крайней мере три типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК являются основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано выше, служит матрицей для биосинтеза белка. Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке структурного гена или структурных генов, регулируемых им. «Считывание» генетического кода, т. е. формирование мРНК, начинается спромотора— участка ДНК, являющегося точкой инициации для синтеза мРНК, и далее распространяется последовательно вдоль оператора и структурных генов. Координированный одним оператором одиночный ген или группа структурных генов образует оперон. Деят-ть оперона находится под контролир-м влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Поскольку структурные гены и ген-регулятор находятся в разных участках цепи ДНК, связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осуществляется при помощи вещества-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфической мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокир. синтеза мРНК и, след-о, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит, в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связываться с определенными низкомолекулярными веществами, называемыми индукторами, или эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний теряет способность связываться с геном-оператором, который таким образом выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК. Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Многочисленные известные регуляторные белки можно разделить по механизму действия на четыре группы. Негативная генетическая регуляция, т. е. выключение соответствующих генов, может вызываться репрессорами. Некоторые репрессоры связываются с ДНК только в отсутствие специфического лиганда. Комплекс репрессора с лигандом в этом случае теряет способность к связыванию и оставляет свободным участок промотора для присоединения РНК-полимеразы. Часто свободный от лиганда репрессор не может связываться с ДНК, т. е. транскрипция подавляется только в присутствии лигандов. Аналогично при позитивной генетической регуляции можно различать два случая. Если связывается только свободный индуктор, транскрипция подавляется соответствующими лигандами. Напротив, многие индукторы становятся активными только после образования комплекса с лигандом. К этой группе принадлежат, например, стероидные гормоны. Лактозный оперон-лактозный оперон бактерии Е. coli (участок ДНК), который подвержен одновременно негативному и позитивному контролю. Оперон содержит структурные гены трех ферм., кот. необходимы для утилизации лактозы, и регуляторные элементы для упр. транскрипцией оперона. Так как лактоза превращается в кл. в глюкозу, экспрессия генов лактозного оперона не имеет смысла, когда глюкоза присутствует в клетке. Действительно гены транскрибируются только в отсутствие глюкозы и в присутствии лактозы. Регуляция достигается благодаря взаимодействию двух регуляторных белков. В отсутствие лактозы lac-penpeccop блокирует участок промотора. При наличии лак. она превращается в изомерную аллолактозу, которая связывается с белком-репрессором и тем самым вызывает диссоциацию репрессора и оператора. Тем не менее этого недостаточно для транскрипции структурных генов. Для связывания РНК-полимеразы необходим индуктор, белок-активатор катаболитных оперонов (САР от англ. catabolite activator protein), который связывается с ДНК только в комплексе с цАМФ (cAMP). Сигнал голодания возникает только в отсутствие глюкозы. Процесс транскрипции начинается с прикрепления РНК-полимеразы, катализирующей синтез иРНК, к опр. участку ДНК, называемому промотором (Р). Когда молекула репрессора "садится" на операторный участок, она "закрывает" промотор, тем самым препятствуя связыванию с ним РНК-полимеразы и началу транскрипции. У прокариот пять генов, кодирующих синтез ферментов триптофанового пути, образуют оперон. Ген-регулятор обеспечивает синтез аллостерического белка — триптофанового репрессора, не активного в свободном состоянии. Последний в таком виде не связывается с операторным участком и, след-о, не может препятствовать началу транскрипции. Когда конеч. пр-т метаболического пути (триптофан) накапл. выше опр. уровня, он взаимод. с репрессором и активирует его. Активированный репрессор присоединяется к операторному участку и подавляет транскрипцию триптофанового оперона. Т. о.триптофан является корепрессором.

55. Принципы регуляции действия генов у эукариот. Транскрипционно активный хроматин. Регуляторная роль, гистонов, негистоновых белков, гормонов. Особенности организации промоторной области у эукариот. Посттранскрипционный уровень регуляции синтеза белков. Роль мигрирующих генетических элементов в регуляции генного действия.

У эукариот наряду с регуляторными процессами, влияющими на функционирование отдельной клетки, существуют системы регуляции организма как целого. Гормоны образуются в специализированных клетках желез внутренней секреции и с кровью разносятся по всему телу. Но регулируют они процессы синтеза РНК и белков лишь в так называемых клетках-мишенях. Гормоны связываются с белками-рецепторами, расположенными в мембранах таких клеток, и включают системы изменения структуры клеточных белков. Те в свою очередь могут влиять как на синтез белков на рибосомах, так и на транскрипцию определенных генов. Каждый гормон через систему посредников активирует свою группу генов. Так, например, адреналин включает синтез ферментов, расщепляющих гликоген мышц до глюкозы, а другой гормон – инсулин влияет на образование гликогена из глюкозы в печени. У эукариот синтез РНК происходит в ядре клетки, а синтез белков – в цитоплазме. Образующиеся в ядре информационные РНК подвергаются там целому ряду изменений под действием ферментов и в комплексе с различными белками проходят через ядерную оболочку. Разные иРНК транслируются в разное время после их образования. Это зависит от того, с какими белками они связаны в цитоплазме. В отсутствие гормонального сигнала некоторые иРНК остаются нетранслированными долгое время. Разнообразие форм и функций клеток разных организмов зависит от сложного взаимодействия различных генов между собой и с многочисленными веществами, попадающими в клетку извне или образующимися в ней. Познание регуляторных механизмов транскрипции и трансляции необходимо для управления процессами реализации генетической информации. С помощью методов молекулярной биологии было исследовано регуляторное действие гистонов и негистоновых хромосомных белков. Как выяснилось, гистоны, особенно гистон H1, оказывают тормозящее действие на ДНК-зависимый синтез РНК. Негистоновым хромосомным белкам тоже приписывают специфические регуляторные функции . Эти белки снимают блокирующее действие гистонов. На их важную роль указывают, помимо прочего, их большое многообразие, неодинаковое содержание их в хроматине различных тканей и на различных стадиях развития, а также результаты экспериментов по реконструкции хроматина. Однако эти данные спорны, так что регуляторное значение гистонов и негистоновых белков остается неясным. У человека важное значение имеет действие половых гормонов. Развитие первичных мужских половых признаков зависит от образования H-Y-антигена , ген которого, вероятно, находится в половой хромосоме. Стероидные гормоны, вырабатываемые гонадами, транспортируются к клеткам-мишеням, связываются имеющимися там аллостерическими белками- рецепторами , изменяют их конформацию и попадают в виде комплекса гормон-рецептор в клеточное ядро . Происходящая после этого активация транскрипции определенных генов, обусловлена воздействием этого комплекса. Промотор у каждого из 100000 генов свой, и хотя можно увидеть в разных промоторах общие элементы, все эти 100 000 промоторов отличаются друг от друга очень сильно. Их длина варьирует от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. На этом пространстве располагаются десятки регуляторных последовательностей различного рода, которые связывают белки, регулирующие транскрипцию. Многие из этих последовательностей определены. Они достаточно коротки и просты. Различные регуляторные элементы работают сообща, связывают регуляторные факторы, которые взаимодействуют друг с другом, и эти факторы связывают в свою очередь другие факторы, которые также взаимодействуют друг с другом. К тому же это связывание и взаимодействия зависят не только от того, какие именно регуляторные элементы находятся в промоторной области, но и от того, как они расположены относительно друг друга, и от того, какие еще непромоторные элементы, иногда очень удаленные от гена, вовлечены в его регуляцию. Для каждого гена образуется уникальная мозаика регуляторных элементов, действие которых не аддитивно. Одна и таже последовательность, в зависимости от того, какие последовательности находятся вокруг нее, может узнаваться разными белками. С другой стороны, один и тот же белок может узнавать разные последовательности. Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не синтезируют все белки. Количество и разнообразие белков, в частности ферментов, определяются степенью их участия в метаболизме. Более того, интенсивность обмена регулируется скоростью синтеза белка и параллельно контролируется аллостерическим путем. Таким образом, синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез специфических белков. В биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор. Мигрирующие генетические элементы (мобильные гены, прыгающие гены), дискретные фрагменты (сегменты) ДНК, способные встраиваться в разные участки генома; их расположение на хромосомах может меняться как в процессе историч. развития мира организмов, так и в пределах жизни одного индивидуума. Найдены практически во всех изученных организмах - от бактерий до человека. Они весьма разнятся по своему нуклеотидному составу и той роли, которую они играют в клетке.

56) Онтогенез как реализация наследственно детерминированной программы развития. Опыты по трансплантации ядер. Методы клонирования генетически идентичных организмов. Функциональные изменения хромосом в онтогенезе (пуффы, «ламповые щетки»); роль гормонов, эмбриональных индукторов. Раздел генетики, изучающий действие генов в онтогенезе, называется генетикой индивидуального развития, феногенетикой или онтогенетикой. Генотип – это программа развития, обусловленная историей развития вида. Фенотип можно определить как результат реализации генотипа в ходе онтогенеза при определенных условиях внешней среды, для которого характерна система признаков и свойств организма. Например, у растений синтез хлорофилла, который контролируется действием генов, не может происходить в темноте, и для этого процесса обязательно наличие света. В идеале каждому генотипу должен соответствовать строго определенный фенотип. Однако такое однозначное соответствие встречается сравнительно редко. Для количественного описания неоднозначного соответствия фенотипа генотипу ввели понятия экспрессивности и пенетрантности генов. Экспрессивностью называется степень выраженности рассматриваемого признака у организмов с одинаковым генотипом. Экспрессивностью характеризуется конкретная особь. Пенетрантностью проявления гена называется отношение числа особей, у которых проявляется данный признак, к общему числу с данным генотипом. Пенетрантностью характеризуется признак в однородной группе особей. При полной пенетрантности (100%) мутантный ген проявляет свое действие у всех особей, имеющих его, а при неполной – лишь у некоторых. Экспрессивность и пенетрантность часто зависят от условия среды, в которой развивается организм: освещения, температуры или влажности. Таким образом, в фенотипе никогда не реализуются все генотипические возможности, т. е. фенотип каждой особи есть лишь частный случай проявления ее генотипа в определенных условиях развития. Формирование различных вариантов признака на основе одного и того же генотипа называется поливариантностью онтогенеза. Опыты по трансплантации ядер: Впервые трансплантацию ядер соматических клеток зародышей в энуклеированные клетки лягушки осуществили американские исследователи Р. Бриггс и Т. Кинг в 1952 году. Ученые, пользуясь микропипеткой, удаляли ядра из яйцеклеток шпорцевой лягушки, а вместо них пересаживали ядра клеток эмбрионов, находящихся на разных стадиях развития. Проведенные исследования показали, что ядра ранних эмбрионов в стадии поздней бластулы и даже ранней гаструлы обладают тотипотентностью и обеспечивают нормальное развитие эмбрионов. Если брать ядра из клеток зародыша на ранней стадии его развития - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и превращается в нормального головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. При пересадке ядер из более дифференцированных клеток (мезодермы и средней кишки) поздней гаструлы у эмбрионов наблюдалось недоразвитие и даже отсутствие нервной системы. После пересадки ядра из клеток более позднего развития яйцеклетки вообще не развивались. В 1983 для трансплантации были использованы ядра неделящихся и полностью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens. После серийной пересадки таких ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Эти эксперименты показали, что некоторые ядра соматических клеток способны сохранять тотипотентность. Пуфы в цитогенетике, вздутия, обнаруженные на т. н. политенных хромосомах; совокупность П. соответствует набору активных (функционирующих) генов в клетке на данной стадии её дифференцировки. Возникновение П. связано с деспирализацией структурных единиц хромосомы — нитей. Крупные П. со сложной структурой называются кольцами Бальбиани. Образование П. детально изучено у представителей двукрылых насекомых (дрозофила). На разных стадиях развития их личинок происходит закономерная смена расположения П. на одних и тех же хромосомах. Это свидетельствует о том, что отдельные участки хромосом функционируют относительно независимо. Показано, что в П. происходит биосинтез ДНК, усиливается синтез и-РНК и белков. Изучение динамики образования П. позволяет понять, как один и тот же хромосомный набор, принципиально сходный во всех клетках организма, участвует в дифференцировке различных клеточных систем. Образование П. контролируется преимущественно генетическими, но также физиологическими и др. факторами. Возникновение новых П. в результате мутаций, под влиянием гормонов, температуры и др. раскрывает перед экспериментаторами широкие возможности управления развитием и дифференцировкой многоклеточных организмов. Сходная с П. картина наблюдается в хромосомах типа т. н. ламповых щёток, обнаруживаемых при образовании яйцеклеток у птиц, рыб, пресмыкающихся и земноводных. В такой хромосоме отдельные участки сильно деспирализуются, образуя петли с повышенной функциональной активностью (синтез РНК и белка). Эмбриональная индукция — взаимодействие между частями развивающегося организма у многоклеточных беспозвоночных и всех хордовых. многие ткани взрослых животных индуцируют нейрализацию эктодермы. также были открыты вещества-индукторы, такие как хордин и ноггин (действуют косвенно, через подавление эпидермального индуктора, его инактивация хордином и ноггином вызывает нейрализацию эктодермы), и многие другие.

57) Гетерокарионы. Химерные (аллофенные) животные. Совместимость и несовместимость тканей. Роль генов У-хромосомы в определении мужского пола у млекопитающих. Мутации, переопределяющие пол в ходе онтогенеза. Гормональное переопределение пола.

Гетерокарионы — клетки, содержащие два или более ядер, имеющих различные генотипы, которые получаются при слиянии соматических клеток. Гетерокарионы могут быть получены искусственно, слиянием клеток растений либо животных, обработкой клеток животных либо протопластов агентами, вызывающими слияние цитоплазматических мембран и, соответственно, слияние цитоплазм. В качестве агентов, вызывающих слияние, могут использоваться некоторые вирусы (например, вирус Сендай) либо поверхностно-активные вещества (лизолецитин, полиэтиленгликоль). При первом делении гетерокарионы, образованные из клеток животных, могут образовывать одноядерные клетки, при этом случайным образом утрачивается часть хромосом одной или обеих родительских клеток (образование анеуплоидов). Так, деление клеток содержащих гетерокарионы клеток человека и грызунов сопровождается потерей большей части хромосом человека с частым сохранением полного набора хромосом грызуна. Такие клетки, полученные слиянием соматических клеток и способные к дальнейшему делению, называют соматическими гибридами. Одно из перспективных направлений биотехнологии — искусственное получение химер (аллофенных животных). Понятие химера означает составное животное. Сущность метода получения химер заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух и более животных. Животные могут быть как одной породы, так и разных пород и даже разных видов. Современная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих 3—4 и более родителей. Химеры обладают признаками животных разных генотипов. Существует два основных метода получения химер искусственным путем: 1) агрегационный — объединение двух и более морул или бластоцист в один эмбрион; 2) инъекционный — микроинъекция клеток внутриклеточной массы (ВКМ) бластоцисты доноров в бластоцель эмбриона-реципиента. В обоих случаях получают особей, ткани и органы которых построены из клонов клеток объединенных (двух или более) эмбрионов. Первыми созданы химеры лабораторных мышей между линиями агути (кремовые) и не агути (черные). Они выглядели крапчатыми. Их окраска сочетала признаки обоих родителей: полосы пигментированной шерсти чередовались со светлыми, каждая полоса представляла клон клетки-родоначальницы. Их использование помогает изучению фундаментальных проблем дифференцировки клеток в процессе онтогенеза, многих вопросов механизма клеточного развития и происхождения отдельных тканей, иммунологического взаимодействия в развитии и т. д. Тканевая несовместимость - невозможность совместного существования клеток и тканей, принадлежащих генетически различным особям и различающихся антигенами. Благодаря существующему в природе генетическому разнообразию клетки и ткани любых двух особей различаются по множеству антигенов тканевой совместимости (называемых также антигенами гистосовместимости, трансплантационными антигенами). При пересадке органа или ткани (трансплантации) через короткий срок после приживления происходит отторжение трансплантата, повреждаемого лимфоцитами и цитотоксичными антителами организма-хозяина (реципиента). Совместимы только генетически однородные ткани, например ткани однояйцевых близнецов. Чтобы сделать совместимыми ткани генетически различающихся особей, нужно каким-то образом вмешаться в выражение генов гистосовместимости, вызвать подавление (репрессию) одних генов и компенсировать деятельность недостающих генов, а это остаётся пока невыполнимой задачей. При разведении лабораторных животных путём близкородственного скрещивания (брат - сестра, дети - родители) сравнительно легко можно вывести линии генетически сходных, а потому и совместимых особей. В трансплантационной иммунологии преодоление тканевой несовместимости достигается подавлением иммунного ответа реципиента и созданием иммунологической толерантности. Это не устраняет несовместимости как таковой, но обеспечивает сосуществование генетически разнородных тканей. Доказательства того, что половые хромосомы определяют пол организма, были получены при изучении нерасхождения половых хромосом у дрозофилы. Если в одну из гамет попадут обе половые хромосом, а в другую — ни одной, то при слиянии таких гамет с нормальными могут получиться особи с набором половых хромосом ХХХ, ХО, ХХУ и др. Выяснилось, что у дрозофилы особи с набором ХО — самцы, а с набором ХХУ — самки (у человека — наоборот). Особи с набором ХХХ имеют гипертрофированные признаки женского пола (сверхсамки). В дальнейшем было доказано, что у дрозофилы пол определяется соотношением (балансом) между числом X-хромосом и числом наборов аутосом. Гормональное определение пола. При изучении роли половых хромосом в развитии гонад было показано, что определяющим у человека является наличие или отсутствие Y-хромосомы. При отсутствии Y-хромосомы происходит дифференциация гонад в яичники и развивается женщина. В присутствии Y-хромосомы развивается мужская система. Очевидно, Y-хромосома производит вещество, стимулирующее дифференциацию яичек. Следующий этап продолжают гормоны, определяющие процесс половой дифференциации плода и его анатомическое развитие. При рождении первая часть программы заканчивается. После рождения эстафета переходит к факторам среды, которые завершают формирование пола—обычно, но не всегда в соответствии с генетическим полом. Это может приводить к появлению транссексуальности, возникновению гетеросексуального, бисексуального или гомосексуального поведения и образа жизни.