28. Генетическая рекомбинация при трансформации. Трансдукция у бактерий. Общая и специфическая трансдукция. Использование трансформации и трансдукции для картирования генов.

Трансформация бактерий – это перенос ДНК, изолированной из одних клеток в другие. Длинные фрагменты молекулы ДНК успешно поглощаются клеткой. Для того чтобы ДНК проникла в бактериальные клетки, они должны находиться в состоянии компетентности. Возникновению компетентности, приобретаемой лишь частью клеток культуры обычно в середине логарифмической стадии роста, способствует особый белок, который вырабатывается в ходе роста культуры. Сначала ДНК связывается с поверхностью компетентных клеток. ДНК, связанная с компетентными клетками, расщепляется специальными нуклеазами до фрагментов, которые проникают в клетку. После попадания в бактерию двуцепочечная ДНК превращается в одно цепочечную: одна нить ДНК деградирует. На заключительной стадии происходит интеграция одноцепочечного трансформирующего фрагмента с ДНК клетки-реципиента. При этом репликация не требуется, и включаемый фрагмент физически объединяется с ДНК реципиента. Весь процесс трансформации завершается в течение 10—30 мин. Частота трансформации разных бактерий составляет около 1 %. Для некоторых бактерий показана трансформация в естественных условиях, например в организме инфицированного животного — для Васcilus рпеитоniае, а также в условиях культуры — для Васcilus subtilis. Это означает, что трансформация — не экзотический прием генетического анализа, а естественный биологический процесс. В то же время в последние годы в связи с развитием генной инженерии широко применяется плазмидная, или векторная, трансформация, которая заключается во введении в клетки бактерий, а также эукариот генов, интегрированных в естественные или искусственные плазмиды. Трансдукцией называют перенос генов из одних бактериальных клеток в другие при помощи бактериофага. Это явление в 1951 г. открыл Н. Зиндер. Известны два основных типа бактериофагов — вирулентные и умеренные. Первые после их размножения в клетке бактерии приводят к ее лизису. Они существуют либо в вегетативном (размножение внутри клетки), либо в зрелом (метаболически инертное состояние вне клетки) состоянии. Умеренные бактриофаги обладают способностью быть в состоянии профага. Профагом был назван геном фага, который включается в бактериальную хромосому, после чего этот геном приобретает способность ауторепродуцироваться вместе с хромосомой бактерии. Такие бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Эти бактерии, хотя они и содержат в своей хромосоме профаг, не имеют в себе инфекционных фаговых частиц. Существование профага является временным. При индукции профаг покидает хромосому бактерий, переходит в вегетативное состояние и размножается. В этом случае в клетке возникают зрелые фаговые частицы, которые вызывают ее лизис. Этот процесс можно вызвать искусственно. Оказалось, что, когда профаг освобождается из хромосомы бактерии, переходя в стадию вегетативного существования, он может уносить с собой часть хромосомы бактерий. При следующем инфицировании гены из фрагмента хромосомы бактерии, унесенного фагом, оказываются способными внедряться в хромосому нового реципиента. Особый интерес имеет так называемая зиготическая индукция, при которой индуцирующим агентом является конъюгация с клеткой Hfr, при последней происходит проникновение хромосомы с профагом из клетки Hfr в нелизогенную клетку F. Обычно при трансдукции переносятся отдельные гены. Однако иногда переносимый сегмент хромосомы содержит два или несколько генов. Анализ таких случаев множественной трансдукции позволил создать карты участков хромосом бактерий. Существует несколько типов трансдукции: общая или неспецифическая - профаг способен включаться в разные места хромосомы бактерии. Это обеспечивает возможность переноса различных локусов из хромосомы хозяина в хромосому реципиента. Перенос генов при общей трансдукции может привести к двум различным состояниям трансдуктантов: а) полная трансдукция - привнесенный ген наследуется стабильно, т.к. интегрирует с хромосомой реципиента; б) абортивная трансдукция – внесенный фрагмент не реплицируется и передается по одной линии при размножении трансдуктантов; 2. специфическая – происходит рекомбинация между фаговой и хромосомной бактериальной ДНК, поэтому фаговые трансдуцирующие частицы обязательно содержат ДНК обоих типов. При использовании рекомбинации по многим генам оказалось возможным построить генетические карты хромосом для генов фагов Т4, Т2, фага лямбда и др. С помощью ряда приемов удалось показать соответствие генетических карт положению генов непосредственно в хромосомах вирусов. При интенсивном перемешивании раствора ДНК происходит разрыв молекул ДНК. Можно добиться режима, при котором молекула ДНК рвется примерно пополам. При заражении бактерий половинками молекул было показано, что они несут в себе половину генетической карты. М. Мезельсон и Дж. Уэйгл показали наличие совпадения расстояния между генами на карте и размером хромосом фага лямбда, используя передачу изотопов при рекомбинировании ДНК фага. Эти генетические карты оказались замкнутыми в круг. Генетические карты кольцевых хромосом изучены для ряда вирусных частиц.