25. Организация генетического аппарата у бактерий. Представление о плазмидах, эписомах и мигрирующих генетических элементах (инсерционные последовательности, транспозоны).

Генетика — это наука, изучающая наследственность и изменчивость. Микроорганизмы обладают способностью изменять свои основные признаки: морфологические (строение); культуральные (рост на питательных средах); биохимические или ферментативные признаки (добавление определенных веществ в питательную среду может вызвать активацию фермента, который до этого находится в латентном состоянии); биологические свойства — может меняться степень патогенности, на этом основаны способы приготовления живых вакцин. Например, при 12—14-дневном культивировании возбудителя сибирской язвы при t° — 42—43°С микробы потеряли способность вызывать заболевание у животных, но сохранили свои иммуногенные свойства. Генетическая информация в клетках бактерий заключена в ДНК (у некоторых вирусов РНК). Молекула ДНК состоит из двух нитей, каждая из которых спирально закручена относительно другой. При делении клетки спираль удваивается. И вновь образуется двунитчатая молекула ДНК. В состав молекулы ДНК входят 4 азотистых основания — аденин, гуанин, цитозин, тимин. Порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их наследственную информацию, закодированную в ДНК. Плазмида – внехромосомный самовоспроизводящийся генетич. элемент (фактор наследственности) бактерий и нек-рых др. организмов. Представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, закрученную в суперспираль. Размеры П. необычайно широко варьируют от 2 тыс. до неск. сотен тысяч пар оснований; нек-рые из них содержат 1-3 гена, другие достигают 10-20% размера бактериальной хромосомы. Нек-рые П., наз. эписомами, обладают способностью существовать в двух состояниях – автономном и интегрированном. В автономном состоянии эписома не является частью бактериальной хромосомы и реплицируется (самовоспроизводится) независимо, хотя и синхронно с ней. В интегрир. состоянии она реплицируется в составе хромосомы. Способность обратимо включаться в состав хромосомы часто сопряжена с наличием в эписомах мигрирующих генетических элементов. Большинство П. может передаваться от одной бактерии к другой при конъюгации клеток (трансмиссибельные П.). Такие П. способны провоцировать конъюгацию между бактериями и тем самым обеспечивают собственную миграцию от клетки к клетке и распространение среди бактерий. Нетрансмиссибельные П. передаются благодаря конъюгативным плазмидам-помощникам. Во мн. случаях для переноса П. между клетками необязательна конъюгация последних. Так, мелкие П. могут передаваться в виде коинтегратов с бактериофагами (вирусами микробов). Число копий П. в клетке зависит от их генетич. особенностей. П., находящиеся под "ослабленным контролем", могут реплицироваться до тех пор, пока каждая клетка не будет содержать в среднем от 10 до 200 копий. П., находящиеся под "строгим контролем", реплицируются примерно с той же скоростью, что и хромосома, и содержатся в клетке в виде одной или неск. копий. В обоих случаях благодаря контролируемой репликации число П. в клетке поддерживается постоянным в ряду поколений. Помимо ряда общих ф-ций, свойственных очень многим П. (таких, как автономная репликация или ф-ция переноса), существует множество спец. ф-ций, детерминируемых той или иной П. У бактерий наиб. изучены три главные группы плазмид: F-П. (факторы фертильности) ответственны за половой процесс, R-П. (факторы резистентности) обеспечивают устойчивость бактериальных клеток к действию антибиотиков (напр., к стрептомицину и тетрациклину) и сульфаниламидным препаратам, в Col-П. (колициногенных факторах) локализованы гены синтеза колицинов (бактериоцинов) – токсичных белков, к-рые не действуют на производящую их клетку, но убивают др. бактерии. Обусловленная П. устойчивость бактерий к антибиотикам основана на разных механизмах, но чаще всего на инактивации последних ферментами (напр., b-лактамазы), кодируемых П., или на избират. изменении проницаемости клеточной оболочки. Среди П., обеспечивающих устойчивость бактерий к антибиотикам, осн. массу составляют т. наз. факторы множеств, резистентности, несущие сразу неск. соответствующих детерминант. С помощью трансмиссибельных П. детерминанты резистентности легко могут распространяться между видами, способными к конъюгации. На такие П. гены резистентности могут передаваться с помощью транспозонов. П. не являются неотъемлемой составной частью бактериальной клетки, однако их наличие расширяет ее генетич. возможности. П. позволяют бактериям получать энергию необычными способами, напр. окислением водорода или метана. П. играют важную роль в эволюции бактерий, особенно в их быстрой адаптации к меняющимся факторам среды. П. с ослабленным контролем репликации широко применяется в качестве векторных молекул в генетической инженерии для решения биотехнол. задач. Мигрирующие генетические элементы (мобильные гены, прыгающие гены), дискретные фрагменты (сегменты) ДНК, способные встраиваться в разные участки генома; их расположение на хромосомах может меняться как в процессе историч. развития мира организмов, так и в пределах жизни одного индивидуума. Найдены практически во всех изученных организмах – от бактерий до человека. Они весьма разнятся по своему нуклеотидному составу и той роли, к-рую они играют в клетке. У прокариот (бактерии и синезеленые водоросли) выделено неск. осн. групп М.г. это – IS- и Tn-элементы, эписомы, а также нек-рые бактериофаги, или фаги (вирусы бактерий, способные ее поражать, репродуцироваться в ней и вызывать ее гибель). IS-элементы – простые вставочные (ин-серционные) последовательности; содержат от 700 до 1500 пар нуклеотидов. Эти сегменты ДНК имеют инвертир. повторы на концах, содержащие обычно неск. десятков нуклеотидных пар, и не содержат никаких генов, кроме тех, к-рые необходимы для их перемещения (транспозиции) по геному. Они встречаются в нек-рых плазмидах (внехромосомные носители наследственности) и умеренных фагах (способны существовать в клетке в форме профага). Транспозиции IS-элементов не сопряжены с их исключением из мест исходной локализации в плазмидах или хромосоме; при транспозиции IS-элемент удваивается и одна его копия остается на прежнем месте, а другая попадает в новый локус (местоположение гена в хромосоме или плазмиде). Таким образом, транспозиции этого элемента сопряжены с репликацией (удвоением) его ДНК. Обычно IS-элементы встраиваются (интегрируют) в разл. места бактериального генома, однако нек-рые участки оказываются более предпочтительными, чем другие. Встраивание и исключение этих элементов происходит с высокой точностью, что свидетельствует об участии в этих процессах ферментов, узнающих инвертир. концевые повторы IS-элементов. Ферментные системы, обусловливающие транспозиции IS-элементов, по крайней мере, частично кодируются их собств. ДНК. Значение IS-элементов для эволюции бактерий связано с тем, что эти элементы при своих перемещениях инактивируют разл. гены или нарушают их нормальную регуляцию. Помимо прямого влияния на экспрессию гена (развития признака, контролируемого данным геном) вследствие транспозиции инсерционной последовательности непосредственно в кодирующую часть гена или его регуляторную зону, эти М. г. э. могут влиять также на транскрипцию (биосинтез информационной РНК на матрице ДНК) окружающих их последовательностей ДНК генома. Это происходит вследствие того, что мн. IS-элементы содержат промоторные (инициирующие транскрипцию) и терминаторные (прекращающие транскрипцию) участки ДНК. Транспозиции IS-элементов могут вызывать слияние двух не связанных ранее генов или оперонов (совокупность связанных между собой генов и прилегающих к ним регуляторных участков) с образованием новых функцион. единиц, а также индуцировать все виды хромосомных перестроек. Соединение разнородных репликонов (элементарная генетич. структура, способная к самокопированию) имеет большое биол. значение, т. к. объединяет ранее разобщенные генетич. детерминанты, подчас принадлежащие разным видам организмов. Tn-элементы (сложные перемещающиеся элементы, или транспозоны) принципиально отличаются от IS-элементов только тем, что содержат дополнит. структурные гены, не имеющие отношения к ф-ции транспозиции. Известно много транспозонов, в состав к-рых входят гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам и др. ядам. При этом один и тот же транспозон иногда несет целый набор детерминант резистентности (т. наз. V-детерминанты). Такие транспозоны наиб. широко распространены, т.к. представляют ценность для селекции бактерий. Существуют транспозоны, содержащие гены, к-рые кодируют токсины, а также свойственные данному организму ферменты. Как правило, Tn-элементы несут на концах целые или частично измененные IS-элементы, к-рые сообщают им способность перемещаться по геному и вызывать в нем те же изменения, что и своб. IS-элементы. Транспозоны вместе с плазмидами и фагами (в к-рые они легко интегрируются) способны осуществлять обмен разл. заключенных в них генов между весьма отдаленными видами бактерий, поэтому они играют чрезвычайно важную роль в эволюции бактерий, включая адаптацию их к лек. в-вам и продуцирования ими новых токсинов. Транспозиция Tn-элементов осуществляется по такому же механизму, как и IS-элементов, и также включает стадию трансляции. Большинство транспозонов не выбирает для своего включения строго определенные последовательности в ДНК. Однако обычно они предпочитают нек-рые районы хромосом и даже специфич. участки, причем разные Тn-элементы различаются по специфичности выбора мест интеграции. К М.г.э. прокариот относят также умеренные фаги. l-Фаги (лямбдоидные фаги) обычно встраиваются в одно место хромосомы, но при определенных условиях могут располагаться и в др. участках генома. m-Фаги способны включаться в любые места бактериальной хромосомы, а также в ДНК мн. др. фагов и плазмид. Интеграция лямбдоидных фагов обеспечивается ферментной системой, состоящей из клеточных белков и белков, кодируемых геномом фага. m-Фаг во мн. отношениях сходен с IS- и Tn-элементами и отличается от них только тем, что может формировать вирусные частицы. Умеренные фаги способны вносить существ. изменения в структуру и функционирование бактериального генома благодаря двум процессам – интеграции фаговой ДНК в хромосому бактерии и трансдукции (переносу фагом бактериальных генов из одних клеток в другие). Важным отличием М. г. э. эукариот от таковых у бактерий является их способность при включении в тот или иной локус изменять св-ва ферментов (продуктов генов-мишеней), а не только прерывать их синтез.

26) Методы, применяемые в генетическом анализе у бактерий и бактериофагов: клональный анализ, метод селективных сред, метод отпечатков и др. До 40-х гг. 20 в. считалось, что, поскольку у микроорганизмов нет ядерного аппарата и мейоза, на них не распространяются законы Менделя и хромосомная теория наследственности. С начала 40-х гг. микроорганизмы становятся объектом интенсивных генетических исследований. Именно на них были решены многие кардинальные вопросы современной генетики. Так, первое указание на то, что материальным носителем наследственности служит дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), было получено в опытах на пневмококках. Генетические исследования микроорганизмов особенно интенсивно стали развиваться после того, как американские генетики С. Лурия и М. Дельбрюк показали на кишечной палочке (Escherichia coli), что и бактерии подчиняются мутационным закономерностям. Ранее существовавшее представление об адекватной, адаптивной изменчивости у бактерий возникло вследствие методической ошибки, заключавшейся в изучении культуры как единицы изменчивости. Был предложен новый принцип изучения изменчивости у бактерий - клональный анализ, т. е. изучение потомства одной клетки - родоначальницы клона. Клональный анализ - м. исследования клеточных взаимодействий в процессе индивидуального развития путем формирования генетических мозаиков (изменение какой-то части организма, развивающейся из мутантной клетки.). Др.опред-е -- изучение потомства одной клетки - родоначальницы клона. Важной вехой в развитии генетики микроорганизмов явился разработанный американскими генетиками Дж. и Э. Ледербергами метод реплик, или отпечатков, позволивший доказать, что мутации возникают у бактерий независимо от условий культивирования, и, кроме того, значительно упростивший приёмы отбора вариантов микроорганизмов с желаемыми свойствами. Метод отпечатков-м. оперативного выявления биохимических мутаций у микроорганизмов; предложен Дж.Ледербергом в 1952, его суть состоит в “перепечатывании” бархатной “печаткой” колоний микроорганизма (в оригинале метода - E.coli), выросших на нормальной среде, в чашки Петри со средой, содержащей селективный агент, например, стрептомицин, - частота мутаций устойчивости к стрептомицину определяется по числу выросших “перепечатанных” колоний. Метод селективных сред С. Н. Виноградский вместо агара или желатины применил гель кремниевой кислоты, иначе говоря, затвердевший силикатный клей с добавками Сахаров и солей, но без азота. Поэтому любая колония, выросшая на такой среде, автоматически оказывалась азот-фиксирующей: ведь необходимый для жизни азот она могла получить только из воздуха.М. сел. сред оказался очень эффективным. Дана задача: из многих миллиардов клеток «дикой», автотрофной бактерии отобрать те, которые потеряли способность синтезировать нез. а/к гистидин. С этой целью культуру бактерий выращивают в жид. ср. без гистидина, но с выс. концентрацией антибиотика пенициллина. Те клетки, которым гистидин не нужен, начинают расти: тут же оболочки их лопаются и бактерии погибают. Ведь пенициллин останавливает рост их оболочек, и увеличивающаяся в объеме цитоплазма разрывает кл.Нуждающиеся в гистидине ауксотрофы остаются живы — они без него не растут. Остается осадить культуру в центрифуге, отмыть от пениц. чистой средой и пересеять на твердую ср., содер. гистидин. Таким способом можно отобрать одну нужную бактерию из сотен миллионов и за сутки получить от нее многомиллионное потомство.

27 Особенности процессов, ведущих к рекомбинации у прокариот. Конъюгация у бактерий: половой фактор кишечной палочки. Методы генетического картирования при конъюгации. Кольцевая карта хромосом прокариот.

Мутационный процесс и поток генов могут создать в популяции изменчивость по единичным генам. Если в результате таких первичных процессов возникает аллельная изменчивость по двум или большему числу генов, то создаётся почва для действия вторичного процесса — рекомбинации, В результате рекомбинации новые аллели, носителями которых первоначально, вероятно, были разные особи, могут сочетаться в одном генотипе. За счет рекомбинации число различающихся генотипов в популяции может увеличиться; этот процесс превращает небольшой первоначальный запас изменчивости по множественным генам в гораздо более значительное количество генотипической изменчивости. Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый переносом генетического материала из клеток донора в клетки реципиента. Процесс конъюгации у бактерий E. coli (кишечной палочки) был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е. Тэйтумом на основании генетического подхода. В основе полового процесса у бактерий лежит конъюгация клеток. Это явление выражается в появлении временной связи между клетками бактерий посредством образования цитоплазматического мостика. Такая связь создает условия для проникновения генетического материала из одной клетки бактерий в другую. При явлениях рекомбинаций у бактерий одна из линий служит донором, а другая реципиентом. донорные клетки (мужские клетки бактерий) характеризуются наличием у них особого фактора F⁺ . При конъюгации бактерий фактор F⁺ может переходить в pеципиентную женскую клетку F, превращая ее в мужскую клетку. Бактерии F, т. е. лишенные полового факторы, являются реципиентами. При конъюгации клеток F⁺ и F в последнюю часто переходит только половой фактор. Однако когда фактор F⁺ в клетки донора интегрируется с ее хромосомой, то конец хромосомы донора начинает регулярно проникать через цитоплазматический мостик в клетку реципиента, обусловливая появление клеток, способных к особо высокой частоте рекомбинаций, которые были обозначены символом Hfr (high frequency of recombination). Кольцевая структура генома. Оказалось, что различные штаммы Hfr переносят гены в клетки-реципиенты в неодинаковой последовательности. Сопоставление этих последовательностей показало, что все они согласуются с единой круговой генетической картой. Единая кольцевая молекула генома Е. соli содержит около 4000 тыс. последовательных нуклеотидов. Она может дополнительно включать F-фактор, имеющий кольцевую форму и состоящий из 60 тыс. п. н., а также другие плазмиды, профаги и иные необязательные элементы. В результате переноса всей хромосомы клетки – рецепиенты приобретают свойства донора. Методы генетического картирования при конъюгации. Проникновение генов донора в клетки реципиента подчиняется отчетливой временной последовательности. Специфический конец хромосомы бактерий Hfr входит в клетку реципиента и постепенно втягивает туда те гены, которые локализованы за ним вдоль по хромосоме. Перенос всего генома — это редкое событие. Таким образом, можно определить последовательность расположения генов и расстояние между ними, измеряя его в данном случае временем, проходящим от начала внедрения в клетку реципиента сначала одного, а за ним последующего гена. При конъюгации в клетку хозяина входит конец хромосомы донора О (от англ. origin — начало), являющейся ведущим локусом. Вслед за локусом О туда же постепенно втягиваются и остальные блоки генов. Хромосома при прерывании конъюгации рвется на разных участках. Фрагмент того или иного размера, входя в клетку хозяина, создает в ней частичную диплоидию. Возникает так называемая мерозигота, путем кроссинговера гены из фрагментов донора переходят в хромосому хозяина и создают в ней новый рекомбинантный генотип. Было открыто, что разные гены последовательно переходят из мужских; в женские клетки бактерий в разное, вполне определенное время. Э. Волльман и Ф. Жакоб разработали метод анализа, который позволил узнать, как бактерии обмениваются между собой генами. Это удалось сделать путем прерывания конъюгации бактерий в разные сроки после ее начала. Если смешать клетки штаммов Hfr и F в отношении 1: 20, то наступит быстрый контакт клеток этих двух штаммов друг с другом. После этого в разные интервалы времени конъюгация бактерий прерывалась механически, при встряхивании взвеси бактерий в гомогенизаторе. Такая обработка разъединяет конъюгирующие бактерии; цитоплазматический мостик, соединявший бактерии, обрывается, при этом разрывается и нить ДНК, проходящая сквозь него из клетки Hfr в клетку F. Перенос генов из хромосом бактерий с помощью их включения в половой фактор получил название сексдукции. В этом случае оказывается возможным получить диплоидию по отдельным генам и изучить доминантность аллелей. Т.о., существует два главных метода картирования хромосом при конъюгации бактерий. Первый из них — это картирование хромосом по градиенту передачи. В данном случае после часа совместной инкубации клеток донора и реципиента определяется абсолютное количество разных рекомбинаций. Этим путем оказывается возможно установить последовательность генов в хромосоме и величины расстояний между ними. Второй способ основан на определении времени прохождения фрагментов хромосомы разной длины из клеток Hfr в клетку F . Прерывая конъюгацию путем встряхивания смешанной культуры, можно подсчитать время, необходимое для появления рекомбинантов по тем или иным маркерам. Метод эффективен для определения расстояния между генами, измеряемого временем не меньшим, чем одна минута.

Генетическая рекомбинация у бактерий происходит не только при половом процессе. Обнаружены также рекомбинации ДНК, идущие при трансформации и трансдукции. В случаях трансформации материал природной ДНК вносится в клетку в качестве свободных фрагментов или фрагментов, захваченных плазмидами. При трансдукции такой материал захватывается вирусами и при инфицировании вносится в клетку.