Kurs_lektsiy_po_mikrobiologii_GGMU_2012

Профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из бактериальной хромосомы и вызывать продуктивную инфекцию.

Умеренные и дефектные фаги

Встраиваясь в бактериальную хромосому, умеренные или дефектные фаги вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Изменчивость лизогенных бактерий может быть связана:

•с приобретением генов, переносимых фагами от их предыдущих хозяев;

•с экспрессией «молчащих» генов бактерий-реципиентов. Фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий.

Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойновоспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний).

Практическое использование бактериофагов:

•фаготерапия;

•фагопрофилактика;

•фагодиагностика.

ГЕНЕТИКА ― наука, изучающая механизмы и закономерности наследственности и изменчивости организмов, а также методы управления этими процессами.

Ген ― наследственный фактор, единица наследственного материала ― определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.

Генотип ― совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.

Фенотип ― совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.

31

Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах

— плазмидах и мигрирующих генетических элементах.

Внехромосомные факторы наследственности

1)автономные – являются репликоном:

•плазмиды

2)неавтономные ― реплицируются только в составе репликона (нуклеоида или плазмиды):

•IS-последовательности;

•транспозоны;

•умеренные и дефектные фаги.

Внехромосомные молекулы ДНК (инсерционные элементы, плазмиды, транспозоны) не являются жизненно важными для бактерий, но придают им новые свойства.

Инсерционные элементы (IS) (от англ. insertion sequence) —

простейший тип генетических элементов, мигрирующих от одной бактериальной хромосомы к другой, или между хромосомой и плазмидой. IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Содержат только гены, необходимые для собственной миграции. Фенотипических признаков не кодируют, самостоятельно не реплицируются.

Свойства IS-последовательностей:

•небольшие размеры ― 800−1400 пар нуклеотидов;

•в свободном состоянии не существуют;

•способны перемещаться по геному, при этом первичный элемент остается на месте, а копия встраивается в мишень.

Функции IS-элементов:

•координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации;

•регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения»);

•индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5−9 пар нуклеотидов) координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов.

Транспозоны — нуклеотидные последовательности, способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую.

32

Свойства транспозонов:

•относительно большие генетические элементы, состоят из 2000−25000 пар нуклеотидов;

•могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы;

•могут мигрировать с одного репликона на другой;

•окружены с обоих сторон (фланкированы) последовательностями ДНК, напоминающими IS-последовательности;

•могут нести информацию о синтезе бактериальных токсинов и ферментов, модифицирующих антибиотики.

Плазмиды — кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации. Их возможные состояния:

•автономное (в цитоплазме);

•интегрированное (в нуклеоиде).

Конъюгативные плазмиды способны к самопереносу из одной клетки в другую. Неконъюгативные плазмиды способны к переносу с помощью конътативных плазмид и бактериофагов.

Функции плазмид:

•регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида;

•кодирующая – вносит в генотип новую информацию.

Плазмиды подразделяются на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий.

F-плазмида, или половой фактор. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. F- плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F- плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим конъюгативность. F-плазмиды содержат только tra-оперон, в их составе нет никаких других генов.

F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии.

Функции tra-оперона:

•детерминирует образование конъюгативных пилей;

•моблизирует на перенос:

–саму конъюгативную плазмиду (F+);

–другую, неконъюгативную, плазмиду;

–участок нуклеоида.

33

R-плазмиды (плазмиды множественной лекарственной устойчивости).

Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий к лекарственным препаратам. Передача R-плазмид привела к их широкому распространению среди бактерий и значительно осложнило химиотерапию инфекционных заболеваний.

Состав R-плазмид:

•r-оперон(-ы) + tra-оперон;

•r-оперон(-ы).

Пути передачи R-плазмид:

•при трансдукции (грамположительные бактерии);

•при конъюгации (грамотрицательные бактерии).

Состав r-оперона:

•гены, детерминирующие синтез ферментов:

–инактивирующие антибиотик;

–модифицирующий антибиотик;

–снижающие проницаемость клеточной стенки бактериальной клетки к антибиотику;

•может содержать:

–транспозон;

–IS-последовательность.

Бактериоциногенные плазмиды (на примере Col-плазмиды E.coli) ―

плазмиды, детерминирующие синтез колицинов (антибиотикоподобных веществ).

Состав Col-плазмид:

• гены, детерминирующие синтез колицина;

•tra-оперон. Особенности Col-плазмид:

•редко интегрируют в нуклеоид;

•обычно репрессированы;

•при их дерепрессии бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает (потенциально летальная плазмида).

Свойства бактериоцинов:

•представляют собой вещества белковой природы и функционируют как антибиотики с узким спектром действия;

•вызывают гибель клетки, не нарушая ее целостности;

•ингибируют синтез ДНК, РНК и белка;

•обладают свойствами эндодезоксирибонуклеаз;

34

•обладают летальным признаком – после выделения бактериоцина бактериальная клетка может погибнуть;

•клетка, выделяющая бактериоцины, устойчива к действию гомологичных бактериоцинов извне.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ

Может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации).

Модификации ― временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды. Модификации находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и ряда других признаков.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее расщепления.

Лактозный оперон состоит из трех линейно расположенных структурных генов, деятельность которых контролируется геном-регулятором.

Структурные гены детерминируют образование трех катаболических ферментов: бета-галактозидазы, трансацетилазы и пермеазы. Работа структурных генов зависит от гена-регулятора и наличия в среде лактозы. Ген-регулятор контролирует образование белка-репрессора. Белок-репрессор при отсутствии лактозы связывается с оператором и блокирует транскрипцию. Поступая в клетку, лактоза связывается с белком-репрессором, в результате освобождается оператор и включается синтез катаболических ферментов на структурных генах.

После полной утилизации лактозы белок-репрессор освобождается и вновь связывается с оператором, блокирует процесс синтеза ферментов.

R-S-диссоциация бактерий ― это образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на тплотной питательной среде. Один тип — R-колонии (англ. rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип — S-колонии (англ. smooth — гладкий) ― имеет круглую форму, гладкую поверхность.

Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям.

Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R- форме. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для

35

большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.

S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.

Свойства бактерий из S- и R-колоний

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ

Мутации ― это изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какоголибо признака. Одновременно у бактерий имеются различные механизмы репарации мутаций, в том числе с использованием ферментов ― эндонуклеаз, лигаз, ДНК-полимеразы.

Генетические рекомбинации

Трансформация — форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток.

Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:

1)адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;

2)проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;

36

3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.

Эффективность трансформации зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, и тем больше образуется рекомбинантных бактерий. Межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.

Трансдукция ― перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага. Фаг переносит небольшой фрагмент ДНК бактерии-донора. В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки: ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам, вредным воздействиям окружающей среды, вирулентность и др. При выходе бактериофага из клетки фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, а следовательно, сохраняются и новые фенотипические признаки. Бактериофаг при трансдукции выполняет только транспортную функцию.

Типы трансдукций

1.Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. В клетки реципиентного штамма могут быть перенесены любые гены донора. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим. Фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов.

2.Специфическая трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на хромосоме бактерий. Образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.

3.Абортивная трансдукция. Принесенный трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.

37

Во время деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве. Конъюгация ― однонаправленная передача генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентной клетками.

Необходимым условием для конъюгации является наличие у бактериидонора F-плазмиды (полового фактоpa), которая контролирует синтез половых ворсинок (sex-pili). Бактерии, имеющие F-плазмиду, называются мужскими (F+) клетками. Женские (F-) клетки не имеют этой плазмиды. Процесс конъюгации между F+ и F- клетками имеет следующие стадии:

1)установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых ворсинок;

2)прохождение генетического материала через канал половой ворсинки от донора к реципиенту;

3)рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УЧЕНИЯ О ГЕНЕТИКЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Генная инженерия в медицинской микробиологии

Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью рекомбинантных штаммов бактерий:

•вакцины;

•гормоны;

•интерфероны;

•цитокины.

Генетические методы, применяемые в микробиологической диагностике:

•процентное содержание Г+Ц бактериальном геноме;

•метод молекулярной гибридизации;

•полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция. Цели:

•обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры;

•идентификация микроорганизмов;

•генотипирование микроорганизмов.

Этапы проведения ПЦР:

•выделение ДНК из патологического материала;

•добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена), добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов;

38

•нагревание;

•расплетение ДНК на две нити;

•охлаждение;

•связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена;

•нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров, ДНКполимераза достраивает вторые цепочки ДНК;

•повторение циклов (30−50) – накопление (амплификация) искомого гена;

•резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена;

•определение продуктов ПЦР с помощью электрофореза.

39

Лекция 5

Противомикробные мероприятия.

Микробиологические основы химиотерапии бактериальных инфекций.

Вмедицинской практике часто требуется контролировать нежелательный микробный рост, ограничивать его появление и скорость, частично или полностью уничтожать микроорганизмы во внешней среде или в живых тканях. Для этого используют физические, химические, биологические или комплексные воздействия на микроорганизмы. Эффект от таких воздействий может быть микробицидным (гибель микроорганизмов) или микробостатическим (прекращение их роста и размножения).

Взависимости от характера и целей антимикробного воздействия различают:

•дезинфекцию — уничтожение на абиотических объектах патогенных микробов (обеззараживание объектов);

•стерилизацию — полное уничтожение на абиотических объектах жизнеспособных микроорганизмов и их спор (обеспложивание объектов);

•антисептику — уничтожение или ограничение роста микроорганизмов в живых тканях;

•деконтаминацию — удаление микробного загрязнения объектов до безопасного уровня;

•консервацию — предотвращение роста и размножения микроорганизмов на объектах.

Дезинфекция — это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение на абиотических объектах патогенных микробов. После дезинфекции могут сохраняться споры микроорганизмов, вегетативные формы погибают.

В медицине применяют физические и химические методы дезинфекции.

Физические методы:

•механические (вытряхивание, проветривание, влажная уборка, стирка с моющим средством);

•действие высокой температуры (проглаживание утюгом, кипячение, пастеризация);

•УФО (облучение бактерицидными лампами);

•ультразвук.

Химические методы. При дезинфекции химическим методом применяют следующие дезинфицирующие вещества:

40