5 Гельпроникающая (молекулярно-ситовая) хроматография

Гельпроникающая хроматография (ГПХ) представляет собой метод разделения молекул, основанный на различии их размеров. Этот метод известен под названием гель-хроматография, эксклюзионная и молекуляр­но-ситовая хроматография.

В качестве НФ в ГПХ используют частицы, имеющие определенные размеры пор. ПФ служат водные или органические элюенты. Наиболее простое объяснение механизма разделения молекул в ГПХ состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и растворителем, протекающим через слой НФ. Молекулы, которые имеют размеры, позволяющие им проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, часть времени теряют на пребывание в порах. Молекулы, имеющие размеры, превышающие размер пор, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, проникающие в поры всех размеров, движут­ся наиболее медленно. Замедление скорости движения веществ вдоль колонки тем больше, чем в большее количество пор способны диффундиро­вать распределяемые частицы. Таким образом, при помощи ГПХ можно разделять смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы.

Сорбенты, применяющиеся в ГПХ, имеют различные свойства. Как правило, их подразделяют на мягкие, полужесткие и жесткие гели. В современной ВЖХ мягкие гели на основе полисахаридов не используются из-за недостаточной механической прочности. Применяют полужесткие гели, получаемые на основе сополимеризации стирола и дивинилбензола (стирогели) или полимеризации винилацетата. Жесткие гели представляют собой стекла или силикагели, имеющие фиксированные размеры пор.

ГПХ часто используют для определения молекулярно-массового распре­деления полимеров и нахождения радиуса частиц. Для этой цели с помощью стандартов полистирола строят градуировочный график зависи­мости логарифма молекулярной массы от объема элюирования. Опираясь на полученную кривую, определяют концентрацию частиц опреде­ленного размера в анализируемой смеси.

6 Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) - вид хроматографии, в которой разделение обеспечивается движением подвижной фазы через нанесенный на подложку тонкий слой сорбента. Продвижение элюента по пластине обеспечивается капиллярными силами. Существует несколько вариантов ТСХ, различающихся способом подачи растворителя. Наиболее распростра­нен вариант с восходящим элюированием. В этом случае элюент наливают на дно хроматографической камеры, а нижний край пластины с нанесен­ными пробами помещают в растворитель. Фронт элюента при этом переме­щается снизу вверх. Известны также варианты с нисходящим, горизонта­льным и радиальным способом подачи элюента.

В зависимости от режима подачи элюента различают ТСХ непрерывного, многократного, ступенчатого, градиентного и двумерного элюирования (элюирование в двух взаимно перпендикулярных направлениях).

Для ТХС применяют выпускаемые промышленностью пластины с закреп­ленным слоем сорбента - силикагелем и оксидом алюминия. Анализируемый раствор объемом 1-5 мкл наносят на пластину с помощью микрошприца или микропипетки. Пробу растворяют в легко испаряющихся растворителях, чтобы размер пятна на пластине был минимальным.

Пластину с нанесенными пробами помещают в камеру для хроматографи­рования. Камера представляет собой плотно закрывающийся сосуд с плоскими стенками. В камере необходимо создать атмосферу, насыщенную парами выбранного растворителя, для устранения краевого эффекта - явления перемещения пятен, находящихся по краям пластины со скорос­тью, отличных от скорости средних пятен.

Выбор элюента в ТХС аналогичен выбору состава элюента в адсорбци­онной хроматографии; предпочтительно применение одно- или двухкомпо­нентных элюентов для облегчения воспроизводимости условий ТХС.

Для оценки степени удерживания применяют величину R_f , равную соот­ношению длины пути вещества к длине пути растворителя от линии старта. Эта величина аналогична коэффициенту емкости (k) в ВЖХ.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения в виде пятен. В случае неокрашенных соединений хроматограмму проявляют в парах йода (коричневое окрашивание пятен) в специальной камере или опрыскивают каким-либо специфическим реаген­том, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. Часто в состав нанесенного слоя готовых пластин вносят люминофор, тогда при облучении пластины УФ лампой при 254 нм пластина флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен.

Методом ТХС возможно не только качественное, но и количественное определение. Количественную оценку можно проводить как непосредствен­но на пластине, так и после перенесения пятна с пластины в приемник.

При определении непосредственно на пластине измеряют площадь пятна каким-либо методом. Предварительно строят градуировочный график в координатах m = f (√ S); S - площадь пятна, m - масса вещества. При содержании вещества в пределах 1-80 мкг эта зависимость линейна.