1. Приготовление и окрашивание препарата «раздавленная капля»

Для прижизненного микроскопирования бактерий готовят препараты раздавленная и висячая капля и исследуют при увеличении ×40. Однако, клетки большинства микроорганизмов бесцветны и прозрачны, что затрудняет их изучение. Поэтому часто препараты для прижизненного исследования микроорганизмов слегка подкрашивают нейтральной краской. Для этой цели используют красители, не нарушающие жизнедеятельность микробов: нейтральный красный, растворы метиленового синего и кислого фуксина слабой концентрации.

Препарат раздавленная капля. На прокаленное и остывшее предметное стекло микробиологической петлёй наносят каплю культуральной жидкости. Покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепенно опускают на неё. При осторожном опускании покровного стекла между стёклами не остаётся пузырьков воздуха, мешающих микроскопированию. Капля культуральной жидкости должна быть небольшой, чтобы после «раздавливания» жидкость не выступала за края покровного стекла.

Препарат висячая капля. По центру покровного стекла наносят микробиологической петлёй небольшую каплю культуральной жидкости и опрокидывают его над углублением специального предметного стекла. Края углубления предварительно смазывают вазелиновым маслом. Капля должна висеть на покровном стекле над углублением предметного стекла. Висячую каплю рассматривают под микроскопом, пользуясь плоским зеркалом. Диафрагму при этом суживают.

Прижизненная окраска микроорганизмов. При приготовлении препаратов раздавленная и висячая капля для лучшей видимости микроорганизмы можно слегка подкрасить, нанося на предметное (покровное) стекло вначале каплю раствора нейтрального красного, а затем каплю культуральной жидкости и смешав обе капли микробиологической петлёй.

2. Приготовление фиксированного мазка микроорганизмов, окрашивание по Граму

Приготовление фиксированного мазка. Предметное стекло прокаливают в пламени спиртовки для лучшего обезжиривания. По центру остывшего стекла микробиологической петлёй, простерилизованной в пламени спиртовки, наносят мазок исследуемого материала. Если культура микроорганизма выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю водопроводной воды, в неё микробиологической петлёй вносят небольшое количество материала и делают мазок. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. Обычно мазки фиксируют термическим способом, проводя предметное стекло 3–5 раз через пламя спиртовки мазком вверх. После фиксации мазок окрашивают, для чего растворы красителей наносят непосредственно на мазок; Фиксированные мазки последовательно окрашивают генциановым фиолетовым (1–2 минуты) и раствором Люголя (1 минута). Затем мазок промывают 96 % этанолом и водой. После промывания дополнительно окрашивают мазок раствором карболового фуксина (30 секунд), промывают водой и микроскопируют в иммерсионной системе. Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в розовый.

2. Приготовление фиксированного мазка микроорганизмов, окрашивание по Цилю-Нильсену

Приготовление фиксированного мазка. Предметное стекло прокаливают в пламени спиртовки для лучшего обезжиривания. По центру остывшего стекла микробиологической петлёй, простерилизованной в пламени спиртовки, наносят мазок исследуемого материала. Если культура микроорганизма выращена на плотной питательной среде, предварительно на стекло наносят каплю водопроводной воды, в неё микробиологической петлёй вносят небольшое количество материала и делают мазок. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. Обычно мазки фиксируют термическим способом, проводя предметное стекло 3–5 раз через пламя спиртовки мазком вверх. После фиксации мазок окрашивают, для чего растворы красителей наносят непосредственно на мазок; На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и 2–3 раза подогревают до появления паров, держа стекло высоко над пламенем. Препарат остужают, промывают водой и обесцвечивают погружением в стаканчик с 0,5 % раствором серной кислоты (погружают, не задерживая, 2–3 раза). Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение 3–5 минут. Затем препарат вновь промывают водой, высушивают и исследуют в иммерсионной системе. При строгом соблюдении режима окрашивания кислотоустойчивые бактерии приобретают красный цвет, а не кислотоустойчивые – синий.