Контрольні запитання

• Процес фіксації атмосферного азоту мікроорганізмами.

• Аеробні фіксатори азоту.

• Методика отримання природних культур азотобактера.

Тема 8. Анаеробні фіксатори азоту

Здатність фіксувати атмосферний азот притаманна багатьом видам роду Clostridium, які є облігатними анаеробами. Найбільш активно засвоює молекулярний азот C. pasteurianum .Це великі палички, у молодому віці рухливі і мають перитріхіально розташовані джгутики, одиночні чи з’єднані у короткі ланцюжки з 2–3 клітин. Перед спороутворенням у клітині накопичуються резервні речовини на зразок крохмалю – гранульоза, завдяки чому клітини забарвлюються йодом у синій колір. Після дозрівання спори гранульоза не виявляється. При спороутворенні клітини потовщуються посередині (клостридіальний тип утворення). Анаеробні фіксатори азоту засвоюють широкий набір сполук, що містять вуглець, які зброджують з утворенням масляної кислоти. Енергію, отриману в результаті бродіння цих речовин, бактерії використовують для конструктивних процесів.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА

Мета роботи: виділити з ґрунту анаеробні фіксатори азоту. і вивчити їх.

Завдання

1. Отримати накопичувальні культури ґрунтових анаеробних фіксаторів азоту (бактерії роду Clostridium).

2. Провести спостереження за процесом бродіння.

3. Вивчити морфологію клітин бактерій роду Clostridium, процес утворення ними спор і накопичення гранульози.

Матеріали та обладнання

1. Мікроскоп МБІ-1, предметні скельця, імерсійна олія, бактеріологічна петля, шпатель, скальпель.

2. Стерильні пробірки, зразки ґрунту.

3. Середовище Виноградського (г/л): глюкоза – 20, двозаміщений фосфат калію – 1, сульфат магнію – 0,5, хлорид натрію, сульфат заліза – сліди, вода з водопроводу.

4. Генціановий фіолетовий, фуксин, розчин Люголю, 96%-й етиловий спирт, карбонат кальцію.

Хід роботи

Накопичувальну культуру вільноіснуючих анаеробних азотфіксаторів отримують на елективному середовищі Виноградського. Середовище розливають у великі пробірки на 2/3 висоти. На кінчику скальпеля в кожну пробірку вносять карбонат кальцію для нейтралізації органічних кислот, що утворилися. Пробірки із середовищем стерилізують за 0,5 атм 20 хв.

Перед посівом бактерій пробірки з середовищем витримують у киплячій водяній бані 20–30 хв для видалення кисню, швидко охолоджують до 50–60° С, занурюючи їх у холодну воду. Відразу після цього кожну пробу ґрунту на кінчику стерильного скальпеля вносять до окремої пробірки. Пробірки поміщають до термостата. Культивують бактерії за температури 28–30° С 7–10 діб. Найбільш суттєвою ознакою розвитку бактерій роду Clostridium у середовищі Виноградського є характерний запах масляної кислоти, який підсилюється за струшування пробірки, і наявність у накопичувальній культурі клостридіальних форм, які містять гранульозу, і вегетативних клітин, одиночних чи з'єднаних у пари. Крім того, середовище в пробірках мутніє і спостерігається активне газовиділення. Результати спостережень заносять до табл. 8.

Із накопичувальних культур готують препарати, відбираючи проби з самого дна пробірки, фарбують розчином Люголя (для виділення гранульози), мікроскопують і мікроскопічну картину замальовують.

Таблиця 8

Розвиток анаеробних азотофіксаторів на середовищі Виноградського

Наявність		Запах масляної кислоти	Газовиділення	Помутніння середовища
клостридій	вегетативних клітин з гранульозою