Експериментальна частина розділ 5. Матеріали і методи

5.1. Лабораторні тварини та схема експерименту

Дослідження проведені на 20 білих не лінійних щурах самцях, вагою 180-240 г.

Перед початком експерименту щури були розподілені на дві групи: 1 - контроль, 2 - дослід. Щурам дослідної групи (n=10) впродовж 5 днів внутрішньом’язово вводили цефтріаксон – (БХФЗ, Україна) в дозі 50 мг/кг ваги у вигляді водної суспензії. Щурам контрольної групи (n=10) протягом 5 днів внутрішньом’язово вводили 0,2 мл дистильованої води. На 6 - тий день проводили визначення сумарного транспорту води та електролітів через епітелій товстої кишки методом перфузії ізольованої ділянки кишки in vivo.

5.2. Обладнання

Перистальтичний насос, термостат, ваги, іономір (ЭВ-74), термометр, іон селективний електрод для Сl‾, пасивний електрод, хірургічний столик, хірургічні інструменти, полум’яно-фотометричний аналізатор рідин (ПАЖ-2).

5.3. Матеріали та реактиви

Лігатури, катетери, фільтрувальний папір, скляні стакани, уретан, розчин Кребса-Хенселайта (ммоль/л) (NaCl-117, KCl-5,9, NaHCO₃-24,8, NaH₂PO₄-1,2, MgCl₂-1,2, CaCl₂-2,5, глюкоза-5,5, бифеноловий червоний-20 мг/л, pH=7,4).

5.4. Моніторинг клінічних параметрів стану щурів

Моніторинг клінічних параметрів стану щурів, які визначались за масою тіла, млявостю (0-3 бали: 0 - норма, 1 – помірно піднята шерсть, 2 – тварина брудна, зменшення спонтанних рухів, 3 – тварина майже не рухається, не реагує на інших тварин), діареєю (0-3 бали: 0 - норма; 1 - м’який чи водянистий стілець, волога пляма навколо ануса до 1 см²; 2 - волога пляма навколо ануса більше ніж 1 см², захватує нижню частину живота; 3 - пляма доходить до грудей), оцінювали щоденно.

5.5. Метод перфузії ізольованої ділянки товстої кишки щура in vivo

Перед початком експерименту щурів утримували на голоді з вільним доступом до води протягом 24 годин. Тварин наркотизували уретаном (Sigma, USA) в дозі 1,1 г/кг внутрішньоочеревенно. Дослідження транспорту води та електролітів у товстій кишці проводили методом перфузії ізольованої ділянки кишки в умовах досліду in vivo [31].

Сталу температуру тіла щурів (37^оС) підтримували за допомогою грілки. Виконували трахеотомію, для попередження респіраторної недостатньості. Робили лапаротомію (розкривали черевну порожнину по білій лінії), після чого підтягували товсту кишку. Зразу ж за ілєоцекальним з’єднанням підводили лігатуру, робили надріз кишки і вводили привідний катетер, по якому подавали перфузійний розчин. Через 6-8 см (візуально визначали ділянку переходу ободової кишки у пряму) дистальніше першої лігатури накладали другу лігатуру і робили надріз кишки. Сегмент товстої кишки промивали теплим фізіологічним розчином, для видалення фекальних залишків. Потім вводили вивідний катетер, який фіксували трохи вище надрізу і з якого збирали відтікаючий (аспірований) розчин. Привідний катетер під’єднували до перистальтичного насосу (МНП1ДУ), за допомогою якого подавався попередньо підігрітий (37°С) перфузійний розчин з постійною швидкістю 0,18-0,2 мл/хв. В якості перфузійного розчину використовували модифікований ізотонічний (фізіологічний) розчин Кребса-Хенселайта [30], (ммоль/л): NaCl – 117; КСl – 5,9; NaHCO₃ – 24,8; CaCl₂– 2,5; MgCl₂ –1,2; NaH₂PO₄–1,2; глюкоза – 5,5 до якого додавали не абсорбований маркер феноловий червоний 20 мг/л; pH=7,4.

Після 60-хвилинної перфузії (еквілібраційний період), відтікаючий (аспірований) розчин збирали впродовж 180 хвилин, через кожні 20 хвилин. Дані, отримані за кожний період, усереднювали.

Евтаназію щурів проводили шляхом введення летальної дози наркозу.

Сегмент кишки, що перфузували, швидко видаляли, розрізали його в повздовжньому напрямку, обережно підсушували фільтрувальним папером. Сегмент кишки сушили в термостаті при 60°С впродовж 20 годин, а потім зважували для отримання сухої ваги в грамах.