Конформації глікозидного зв’язку

Глікозидний зв’язок, як уже відмічалося, представляє собою зв’язок С1’-N9 для пуринових та С1’-N1 для піримідинових нуклеозидів. Торсійний кут даного зв’язку називається χ і може набувати надзвичайно широкого діапазону значень. Одначе, як буде показано пізніше, тут також є свої основні найбільш поширені конформації.

Глікозидні торсійні кути визначаються, в основному, по площині чотирьох основних атомів:

1. Для пуринів О4’-С1’-N9-C4,

2. Для піримідинів O4’-C1’-N1-C2.

В теорії існує два основних низькоенергетичних діапазони значень для глікозидного кута, які також були підтверджені експериментально:

1. Конформація анти, коли сторони N1,C2 пуринів та C2,N3 піримідинів повернуті у дальній бік від цукрового залишку (слайд 13а), таким чином атом С8 пуринів та С6 піримідинів нависають над кільцем пентози. Водневі зв’язки пари за цих умов направлені від площини пентози.

2. Конформація син, коли основа, навпаки, повністю нависає над цукром, причому групи водневих зв’язків у парах орієнтовані у бік цукру, особливо, у бік атома О5’ (слайд 13б).

Деякі пуринові нуклеотиди у кристалах з син-конформацією виявляли здатність формувати водневий зв’язок між атомами О5’ та N3, що сприяло стабілізації структури. У будь-якому випадку, для пуринів конформація син є трохи менш вигідною, оскільки, навідміну від анти, створює декілька стеричних перешкод. Виключенням можна вважати гуанозинові нуклеотиди, які все ж таки частіше зустрічаються саме у син-конформації, оскільки у даному випадку виникають вигідні електростатичні взаємодії між екзоциклічною N2-аміногрупою гуаніну та 5’-фосфатним атомом.

Для піримідинових нуклеотидів конформація анти є більш поширеною, ніж син, оскільки у останньому випадку існує невигідний контакт між О2 основи та 5’фосфатною групою.

Результати розрахунків мінімізації молекулярно-механічної енергії у атомному силовому полі за програмою AMBER для обох син- та анти-форми представлені у таблиці на слайді 13.

Стерично вигідні діапазони глікозидних кутів є наступними:

Значення кута χ у регіоні близько – 90⁰ дуже часто називають «високо-анти». Також варто відмітити, що існують явні корелятивні явища між конформацією глікозидного зв’язку та складчастістю цукрів у нуклеотидах – наприклад, глікозидні кути для син-конформацій ніколи не знаходять поруч з варіантами складчастості С3’-ендо, оскільки у цьому випадку існують стеричні перешкоди між основою та Н3’-атомом цукру, який направлений у сторону основи у даному випадку.

Модифікації основ нк

Пурини та піримідини у складі нуклеотидів можуть зазнавати ряду спонтанних змін ковалентної структури. Швидкість таких змін, як правило, є дуже низькою, але вони мають певне фізіологічне значення, оскільки клітина має невеликий рівень толерантності змін генетичної структури.

Перманентні зміни у будові ДНК називаються мутаціями, вивчення яких набуло останнім часом потужного поштовху, оскільки був виявлений зв’язок між мутаціями та старінням і канцерогенезом.

Однією з найпростіших змін структури ДНК або РНК є спонтанна втрата аміногруп основ – дезамінування (слайд 15). Наприклад, за типових клітинних умов, дезамінування цитозину на урацил в ДНК відбувається раз на 10⁷ цитидинів у 24 години. Це відповідає приблизно 100 спонтанним дезамінуванням за день. Дезамінування гуаніну та аденіну відбувається приблизно у 100 разів повільніше.

До речі, можливо, саме здатність цитозину дезамінуватися подібним чином і лежить в основі сенсу заміни урацилу на тимін у складі ДНК. Таким чином, урацил, якого в складі ДНК не повинно бути, швидко впізнається та видаляється системами репарації. Якби урацил був присутній у якості нормальної основи в ДНК, це призвело б до значної зміни генетичного матеріалу лише завдяки спонтанному дезамінуванню. До того ж, кількість Г-Ц пар не уклінно б зменшувалося на користь пар А-У, що призвело б до зростання нестабільності ДНК.

Ще однією важливою реакцією у нуклеотидах є гідроліз глікозидного зв’язку між цукром та основою, який іде набагато швидше та частіше у випадку пуринів, і називається апуринізацією або апіримідинізацією. Ця реакція у випадку пуринів відбувається так, що приблизно 10000 пуринів на одну тваринну клітину втрачається за 24 години. У РНК апуринізація йде набагато повільніше, до того ж не вважається фізіологічно значимою.

За експериментальних умов втрата пуринів може бути пришвидшена у кислих умовах. Наприклад, інкубація ДНК за рН 3 призводить до селективного від’єднання пуринових основ та формування апуринової НК.

Ще одним прикладом модифікацій ДНК є формування піримідинових циклобутанових димерів, яке проходить під впливом УФВ за рахунок конденсації двох етиленових груп. Найчастіше утворюються так звані тимінові димери між двома сусідніми тимінами одного ланцюга (слайд 15). Також за рахунок УФВ може утворюватись інший тип продукту – 6-4-фотопродукт (той же слайд).

Опромінення у більш енергетичному рентгенівському діапазоні (Х-промені та гамма-промені) може призвести до відкриття кільця та фрагментації основ, так само, як і до розривів у ковалентному кістяку НК.

Формування піримідинових димерів відбувається за умов опромінення НК близьким спектром довжин хвиль УФВ (200-400 нм), який є частиною спектру сонячного випромінювання. Тому такі та інші модифікації, як правило, відбуваються з ДНК клітин епітелію та з бактеріальною ДНК. Крім того, ми знаходимося під постійним іонізуючим опроміненням з боку космічних променів та випромінення природних радіоактивних копалин (тератогенні джерела) – радію, плутонію, урану, радону, ₁₄С, ₃Н. Ще однією формою опромінення є антропогенні джерела – медичні прилади (флуорографія, рентген), радіаційна терапія, тощо. Підраховано, що близько 10% змін у ДНК людини спричинюються саме даними факторами.

Ще одним джерелом неферментативних модифікацій НК є вплив реактивних хімічних речовин індустріального походження. Іноді вони самі по собі не є шкідливими, але метаболізують у клітині до небезпечних форм. Такі речовини можна поділити на два основних класи:

1. Дезамінуючі агенти – наприклад, нітритна кислота (HNO₂), що може метаболізувати до нітритів або нітратної кислоти,

2. Алкілюючі агенти.

Нітратна кислота, яка може формуватися з органічних попередників, таких як нітрозаміни, або з нітритних та нітратних солей, є потенційним акселератором дезамінування основ. Схожий ефект має бісульфіт, тому обидві речовини використовуються у якості консервантів їжі для пригнічення росту токсичних бактерій, причому майже не має канцерогенного ефекту.

Алкілюючі агенти, про які ми детальніше поговоримо у темі, присвяченій методам вивчення НК, можуть змінювати структуру ДНК. Наприклад, високо реактивний диметилсульфат може етилювати гуанін, перетворюючи його на 06-метилгуанін, що не здатен входити у пару з цитозином. Ще одним агентом, який, до того ж, присутній у клітинах за нормальних умов, є S-аденозилметіонін.

Можливо, найбільш важливим джерелом спонтанних змін НК у клітині є дія активних форм кисню (АФК), тобто, окисний стрес. АФК, серед яких найбільш відомими є пероксид водню, гідроксил-радикал та су пероксид-аніон, можуть з’являтись у клітинах або у процесі опромінення через іонізацію води, або у якості побічних продуктів дихання мітохондрій. Найбільш активними у плані оксидативного пошкодження ДНК виступають гідроксил-радикали. Для захисту від таких агентів клітини мають захисну систему, що включає у себе ферменти каталазу та супероксиддисмутазу, одначе не весь об’єм АФК, що утворюється в клітині, знешкоджується.

Ще одним типом модифікацій ДНК є ензиматичне метилування основ у її складі. Аденін та цитозин метилуються частіше, ніж гуанін та тимін. Метилування, в основому, відбувається в певних регіонах молекули. У деяких випадках сенс метилування зрозумілий, у інших – його функція невідома.

Всі відомі насьогодні метилази ДНК використовують у якості донора метилу лише S-аденозилметіонін. Наприклад, E. coli має дві основні метилазні системи:

1. Система модифікації-рестрикції - захищає клітину від чужорідної ДНК шляхом введення у власну ДНК метильних груп, яка не піддається дії нуклеаз, в той час як чужорідна (неметильрована) знищується.

2. Система, яка метилює аденозинові залишки у складі послідовності 5’-GATC-3’, перетворюючи основу на N6-метиладенозин. Таке метилування здійснюється ферментом ДАМ-метилазою (ДНК-аденін-метилування), який є компонентом системи репарації неправильно поєднаних пар основ у процесі реплікації ДНК.

У клітинах еукаріот приблизно 5% цитидину у ДНК етилюється до 5-метилцитидину. Таке метилування найбільш наявне у послідовності CpG, причому здійснюється симетрично на обох ланцюгах одразу. Таке метилування, як вважають, пригнічує міграцію мобільних елементів ДНК, так званих транспозонів. Такі метилування цитозину також мають структурне значення, оскільки допомагають ДНК переходити з однієї форми у іншу.