Ямр, як метод вивчення структури та динаміки нк

Основним принципом ядерного магнітного резонансу є детекція у магнітному полі тих атомних ядер у молекулі, які мають так званий ядерний спін. Наприклад, протони дуже широко представлені у НК та олігонуклеотидах, тому можуть бути виявлені як спін-сигнали. Такі сигнали, що називаються технічними зсувами, є залежними від так званого ефекту екранування їх сусідніми оточуючими атом протонами, тому можуть бути використані у якості визначників хімічного оточення навколо відповідного протону певного атома.

Найкраще спінові технічні зсуви, залежні від конформації, виявляються на рівні протонів дезоксирибози, що варіюють в залежності від складчастості цукру. Інші ядра атомів є менш чутливими, ніж протони, до того ж менш розповсюджені у структурі ДНК та РНК, одначе, розміщення таких атомів, як ₁₃С та ₁₅N у структурі НК також може бути виявлене за допомогою магнітних полів високої інтенсивності, що використовуються у ЯМР. Окрім структури НК, ЯМР дозволяє вивчати також взаємодії останніх з білками та малими молекулами, через моніторинг характеристичних змін у хімічних зсувах певних атомів.

Магнітні взаємодії між парою протонів збільшують так звану константу спін-спін сполучення ЯМР, яка прямо залежить від двостороннього кута між ними – так зване відношення Карплуса. Таким чином, вимір константи сполучення може дати пряму та достовірну інформацію щодо складчастості цукрів та конформації кістяка НК чи олігонуклеотиду, або нуклеотиду (наприклад, значення глікозидного кута між цукром та основою). Використання ₁₃С та/або ₁₅N для мічення нуклеотидів дозволяє визначення констант сполучення для недоступних у нормальних умовах торсійних кутів.

Однією з переваг методу ЯМР є визначення структури молекул прямо у розчині шляхом виміру констант протон-протонного сполучення та визначення ядерного ефекту Оверхаузера, через який можна виявити дистанції між атомами. Такий підхід називається 2D-ЯМР. Отже, не потрібно кристалізувати молекули, як у рентгенівській кристалографії. Ще однією перевагою методу є те, що дослідні речовини у розчині ведуть себе більш схоже до умов in vivo та фізіологічних процесів, ніж у твердому кристалічному стані.

Одначе, методики, що порівнюються, не повинні розглядатися у якості альтернативи одна одній, скоріше, вони є доповнюючими. Наприклад, результати ЯМР підкреслюють саме гнучку природу структури ДНК та РНК та той факт, що деякі їх компоненти, наприклад, цукри, майже постійно рухаються.

Існує певне число обмежень в акуратності та достовірності методів ЯМР по відношенню до НК:

1. Обмеження розміру молекули, яке, в принципі, не діє на рівні кристалографії. Пояснюється тим, що у дуже великих молекулах ДНК та РНК реєструється відповідно велика кількість технічних зсувів, які можуть накладатися один на один.

2. Ефект Оверхаузера є значним лише по відношенню до протонів, тому геометрія фосфатів далеко не повністю ним визначається.

3. Оскільки вищенаведений ефект сильно залежить від інвертованої величини відстані між протонами, він розповсюджується лише на дуже невеликі відстані (менше 5-6 А), тому довші відстані в молекулі ДНК (наприклад, ширина боріздки) не можуть бути визначені даним методом.

4. Найбільш достовірні дані ЯМР НК поширюються лише на певні аспекти структури ДНК – парування основ, складчастість цукрів, розміщення сайтів приєднання лігандів. Це, в основному, пов’язане з невеликою кількістю результатів ЯМР у порівнянні з тисячами напрацьованих дифракційних картин.

Ефективною роздільною здатністю для ЯМР НК є значення, менші ніж 3-4 А, навідміну від невеликих глобулярних білків (менше 25 кДа), для яких отримано набагато більше даних ЯМР з вищою роздільною здатністю через ефект Оверхаузера, через більшу компактність даних молекул.

Стандартним підходом у ЯМР-дослідженнях є визначення структури за допомогою методів помірної молекулярної динаміки для виявлення грубої стартової моделі. Програмами для обробки даних найчастіше є X-PLOR та CNS, що допомагає, таким чином, співвідносити дані ЯМР з кристалографічними результатами. Причому відстані, отримані за допомогою ефекту Оверхаузера, подаються як обмеження конформаційної структури. Також знімаються та порівнюються значення конформаційних кутів. Відбувається систематизована обробка даних, і таким чином формується модель або набір моделей.

Як правило, дані, отримані за допомогою ефекта Оверхаузера, подаються і розглядаються у вигляді трьох масивів сигналів:

1. Довгі сигнали (4-6 А),

2. Середні сигнали (3-5 А),

3. Короткі сигнали (2-3,5 А).

Всі сигнали збігаються з відповідними відстанями між атомами. Також для виявлення неточностей використовується методика порівняння отриманих даних з існуючими, отриманими на відомих структурах (так, як і пошук у кристалографії).

ЯМР дає на одну, як у кристалографії, а одразу цілий ряд картин однієї молекули (слайд 18, представлено сумарну картину з десяти форм, отриманих з квадруплексу промотора гену bcl-2 людини). Така група даних є результатом багатьох вимірів та спостережень, зведених докупи (хоча їх кількість і є меншою, ніж у випадку кристалографії), до того ж вона вказує на мобільність та гнучкість даної структури та окремих її регіонів – як правило, пари основ у НК є найменш гнучким елементом у порівнянні з екстархеліксними петлями.