Малі молекули, що нековалентно приєднуються до борозенок в днк

Багато з біологічно активних речовин різної природи реалізують свою дію через приєднання до борозенок ДНК. Багато з них характеризуються антипаразитичною або антивірусною активністю. Як правило, такі молекули приєднуються переважно у ділянках розміщення А/Т пар ДНК, до того ж, на відміну від інтеркаляторів, майже не змінюють структуру НК.

Такі молекули майже завжди приєднуються до малої борозенки у складі В-ДНК. Певна частина їх також діє у якості простих інгібіторів або блокаторів транскрипції або ДНК-топоізомераз. Також такі ліганди можуть бути застосовані для дизайну сиквенс- специфічних молекул, здатних до впізнавання унікальних послідовностей геному.

Одним з виключень до правила приєднання таких речовин виключно до А/Т сайтів на ДНК є антиканцерний антибіотик хромоміцин, який складається з п’яти цукрових кілець, що приєднані до трициклічного, більшістю своєю ароматичного хромофора. Спочатку вважалося, що дана речовина просто інтеркалює в ДНК, оскільки вона мала високу спорідненість до сайтів з як мінімум трьома парами Г-Ц.

Але у 2004 році, коли Ху з колегами отримали кристалічну структуру комплексу хромоміцину з послідновістю d(TTGGCCAA) (слайд 19, з трисахаридом у вигляді кулевої моделі та координуючим йоном магнію у центрі), було доведено, що цей антибіотик не інтеркалює, а просто приєднується до розширеної у регіоні пар Г/Ц малої борозенки В-дуплексу у якості димеру. Велику роль у утворенні такого комплексу відіграє йон магнію, який взаємодіє з двома хромофорами хромоміцину координаційно, інші два зв’язки зайняті молекулами води, які також взаємодіють з різними атомами кисню цитозинів у малій борозенці. Таким чином, специфічність хромоміцину до ділянок з Г/Ц-парами визначається лише необхідністю утворювати водневі зв’язки з цитозинами та атомами N2 гуанінів у малій борозенці, причому у даному випадку ДНК таки змінює свою конформацію – стає помітнішим різкий вигин ланцюгів, а також 10⁰ кута хеліксного вигину.

Прості молекули, що приєднуються до борозенок. Серед таких молекул, які зв’язуються з А/Т парами В-ДНК, але не з дуплексними РНК та А-ДНК, варто відмітити відомі барвники Hoechst 33258 and DAPI, а також антитрипаносомні агенти береніл та пентамідин (слайд 21). Було показано, що дані молекули приєднуються до ДНК з афінністю, типовою для інтеркаляторів (близько 10⁶ моль^-1), але не порушують структуру ДНК.

Як правило, всі молекули, що приєднуються у малої борозенки В-ДНК мають такі загальні риси:

1. Один або декілька позитивних зарядів,

2. Ароматичні або гетеро ароматичні кільця, які поєднані лінкерами, а не злиті,

3. Форму вторинної структури у вигляді хреста у трьох вимірах.

Багато комплексів ДНК з такими молекулами було отримано на основі дуплексів додекануклеотидів, до яких відноситься також і вже відома нам структура Дікінсона-Дрю - d(CGCGAATTCGCG), та споріднені з нею, наприклад, d(CGCAAATTTGCG). Як правило, ліганд приєднується до А/Т регіону такої послідовності, причому ароматичні групи першого лежать між двома цукрово-фосфатними кістяками дуплексу вздовж довгій вісі останнього (слайд 22, на прикладі Hoechst 33258).

У даному регіоні мала борозенка є надзвичайно вузькою, тому атоми кістяка, які формують її підлогу, вступають у Ван-дер-Ваальсові взаємодії з лігандом. Такі гідрофобні зв’язки включають у себе неполярні атоми С1’/Н1’, С4’/Н4’ та С5’/Н5’ кістяка, які показані на слайді 22 на прикладі додекамера Дікінсона-Дрю.

Як правило, водневі зв’язки між лігандом та ДНК також мають місце, причому у більшості випадків – між донорним атомом у складі гетероциклу ліганду або тим, що розміщений у складі амідинової групи, та атомами О2 тиміну або N3 аденіну (слайд 23 на прикладі Hoechst 33258). Така взаємодія являє собою пряме зчитування і залежить від напрямку ходу ланцюгів. Також, у даному випадку можливі варіанти і непрямого зчитування, які можливі через:

1. Наявність вузької перехресної ділянки з молекул ліганду, які комплементарні до ширини малої борозенки,

2. Присутність негативного електростатичного потенціалу у А/Т ділянках малої борозенки, що доповнює позитивні заряди на ліганді.

Як правило, взаємодія з борозенкою включає у себе тісний зв’язок внутрішньої поверхні ліганду з підлогою борозенки. Таким чином, ділянка з Г/Ц-парами, яка має екзоциклічну аміногрупу у складі гуаніну, може ускладнити такого типу взаємодію, оскільки дана аміногрупа виступає опуклістю на поверхні малої борозенки. А сам ефект комплементарності всіх згинів та кривизни підлоги малої борозенки у А/Т-регіонах до внутрішньої поверхні деяких лігандів, що забезпечує ефективний контакт між ними, отримав назву «ізохелікальності» - термін, введений Гудселлом та Дікінсоном ще у 1986 році. Сама ізохелікальність походить саме від структури подвійного хеліксу ДНК. На слайді 24 представлено чотири ліганди, структура яких приведена до ізохелікального стану, тобто повторює згин малої борозенки, а стрілками позначені можливі водневі зв’язки.

Таким чином, основними зв’язками, стабілізуючими ліганди у малій борозенці, є водневі та гідрофобні, а у випадку зарядів на ліганді - електростатичні. Також варто врахувати, що дуже часто у процесі приєднання ліганду до борозенки у А/Т-регіонах ДНК відбувається витіснення з поверхні останнього частини хребта гідратації, особливо стосовно гідрофобних ділянок лігандів, що також впливає на кінетику взаємодії.

Одним з найвідоміших класів молекул, що приєднуються до малої борозенки, прийнято вважати ліганди з двома аміди новими групами - по одній на кожному з кінців. Типовим з таких речовин є береніл, який містить тіазинову групу, що поєднує два фенільних амідинових залишки. У результаті приєднання до В-ДНК молекула такого ліганду закриває собою 3-4 А-Т пари, причому кожна з амідинових груп має зв’язок N-Н у регіоні борозенки, який взаємодіє з атомами О2 тиміну та N3 аденіну через молекулу води.

Ще одним цікавим прикладом біс-амідинових препаратів є пентамідин – лікувальний препарат проти бактерії Pneumocystis carinii, яка викликає пневмонію у хворих на СНІД. Такий препарат має гнучкий лінкер та приєднується до ДНК у такий же спосіб, як береніл. Молекула ліганду діє на патоген, можливо, через інгібування топоізомераз останнього через приєднання до збагачених на А/Т ділянки регіонів, які є точками селективності ферменту. Одначе даний ліганд є високотоксичним також і для здорових тканин, що обмежує його терапевтичне використання.

Наступним прикладом лігандів до ДНК є дикатіонні молекули діарилфуранів, що дуже схожі за стуктурою на береніл та є менш токсичними та більш активними, особливо їх циклогексильне похідне, яке майже у 100 разів ефективніше простого пентамідину (слайд 25). Було показано, що у комплексах з ДНК дана речовина своїми циклогексильними групами точно та щільно входить у малу борозенку та утворює численні контакти з неполярними атомами, що розміщені у лінію вздовж борозенки.

Також існують дані щодо комплексів ДНК з ще одним похідним діарифуранів, так званим DB289, який є проформою препарату 2,5-біс(4-амідинофеніл)фурану(фурамідину), що є дуже активним проти трипаносом та останнім часом інтенсивно тестується (Вілсон з колегами, 2005 рік). Припускається, що дана речовина здатна ефективно зв’язуватися з А/Т-ділянками ДНК кінетопластів трипаносом з утворенням ізохелікального комплексу.

Деякі з лігандів малих борозенок ДНК, хоча й мають спорідненість до А/Т регіонів та є активними, але не характеризуються ізохелікальністю, оскільки за структурою лінійні або близькі до витягнутих. Прикладом таких речовин може слугувати майже лінійна молекула діамідину СGP40215A (cлайд 25 внизу). Кристалічна структура комплексу цього ліганду з дуплексом ДНК d(CGCGAATTCGCG)₂, отримана Нгуеном у 2002 році, показує, що дана речовина приєднується у А/Т-регіоні малої борозенки, причому дві центральні аміногрупи ліганду формують міцні головні водневі зв’язки з атомами О2 тимідинів, але одна кінцева частина молекули зв’язується короткими опосередкованими через воду контактами з парами основ ДНК, а протилежний кінець взагалі не приєднаний до ДНК (слайд 26).

Інший лінійний ліганд, DB921, також має закручену біфенільну групу, поєднану лінійно з бензімідазольним кільцем, що дає пряму молекулу, яка не може бути ізохелікальною, хоча ефективно зв’язується з А/Т-регіонами В-ДНК. Кристалічна структура комплексу ДНК з DB921, отримана Міао зі співробітниками у 2005 році, показує існування опосередкованого водою контакту пар основ ДНК з одним з кінців молекули ліганду, що ефективно мімікує ізохелікальність за її відсутності (слайд 26).

Ще одним прикладом зв’язаних з ДНК молекул є Hoechst 33258, який використовують у якості барвника ДНК та хромосом. Показано, що сайт приєдання даної молекули складається з 4-5 пар основ, більшість з яких є А-Т парами, але присутня одна Г-Ц пара на кінці послідовності.

Виявлено, що два бензімідазольних кільця молекули ліганду формують сітку розгалужених водневих зв’язків з трьома послідовно розміщеними А-Т парами (слайд 22 зліва та 23). Одначе у даному випадку піперидинове кільце ліганду не є планарним, тому завелике для ефективного уведення в район малої борозенки. Замість цього молекула зміщується до розширення борозенки у регіоні 3’-кінця сайту зв’язування, де розміщена пара Г-Ц.

Існує також синтезований ліганд на основі Hoechst 33258, у якому кількість бензімідазольних кілець доведена до трьох, тому він називається TRIBIZ (слайд 27). Така речовина міцно зв’язується з сайтом ДНК довжиною 7,5 пар основ (слайд 27), причому кожна з імідазольних груп утворює по парі розгалужених водневих зв’язків з двома послідовними А-Т парами. Така структура ліганду забезпечує максимально можливу кількість водневих зв’язків з малою борозенкою ДНК, хоча структура самї молекули ДНК при цьому дещо змінюється.

Ще одними прикладами лігандів малої борозенки ДНК є натуральні антибіотики нетопсин та дистаміцин (слайд 28). Обидва відносяться до речовин, що містять поєднані між собою N-метилпірольні та амідні одиниці, причому нетопсин має два катіонних заряди, коли дистамін – лише один.

Ці антибіотики мають спорідненість до малої борозенки у А/Т регіонах, і, як показують структурні дослідження, щільно входять у борозенку за їх місцем зв’язування. Кожна амідна група даних препаратів має атоми азоту орієнтованим в бік борозенки, що дозволяє їм формувати часто розгалужені водневі зв’язки з атомами-донорами аденінів та тимінів у складі пар основ. Такий тип взаємодії називається зв’язуванням класу І. Зв’язування класу ІІ, яке зустрічається набагато рідше, являє собою знижене за селективністю приєднання ліганду до ДНК, причому перший виявляється з невпорядкованими кінцями.

У 2005 році Гудвіном, Лонгом та Георгіадісом була отримана кристалічна структура комплексу нетопсину з ДНК з послідовністю d(CTTAATTCGAATTAAG), що фланкована білками з кінців (слайд 29), з якої було виявлено, що дві молекули ліганду приєднуються у двох сайтах ААТТ однієї послідовності. Таніусом з колегами у 2006 році були також отримані схожі комплекси з діамідиновим похідним бензімідазолу. Дані речовини показують схожі варіанти приєднання до ДНК, що включають у себе взаємодію з А/Т-ділянками через комплементарність з вузькими стінками малої борозенки та прямі або опосередковані водою водневі зв’язки ліганду з підлогою борозенки та/або парами основ. Відсутність екзоциклічних аміногруп гуаніну у даному випадку забезпечує краще розпізнавання поверхні борозенки лігандом. На слайді 30а представлено варіант розпізнавання нетопсином та дистаміцином А-Т пари ДНК за допомогою водневих зв’язків. Розпізнавання ж Г-Ц пар через екзоциклічну групу гуаніну, що представлена на слайді 30b, має власну назву – «лекситропсинове», бо зустрічається у лекситропсинах – так називаються молекули лігандів, які можуть міняти специфічність зв’язку з ДНК за рахунок зміни полярності водневих зв’язків, наприклад, через імідазольне кільце у своєму складі.

Було виявлено, що дистаміцин може також формувати комплекс з ДНК у співвідношенні 2:1 у регіоні дуплексу ДНК d(CGCAAATTTGCG). Таке приєднання до малої борозенки ДНК характеризувалося димерністю за принципом нетипового антипаралельного розміщення молекул «голова до хвоста» (слайд 31 зліва та 32). Позитивно заряджені кінці двох молекул дистаміцину знаходилися далеко один від одного в такому димері, що свідчить про можливість схожої побудови комплексів за участю лігандів, які містять лише один позитивний заряд, наприклад, Hoechst 33258.

Детальне вивчення схожих комплексів 2:1 ДНК з поліамідами Im-Py-Py показало, що між молекулами існують як водневі, так і інші нековалентні взаємодії, а щодо водневих зв’язків, то кожна з молекул ліганду мала контакти лише з одним з ланцюгів (слайд 33), як і у випадку дистаміцину. Причому, цікавим є той факт, що у комплексах ДНК з дистаміцином 2:1 ширина малої борозенки на контактній послідовності 5’-АААТТТ для входження до борозенки обох молекул повинна складати 6,8 А, а не 3,4, як у комплексі 1:1. Таким чином, у даному випадку сама борозенка повинна мати не ригідну, а достатньо гнучку геометрію.

Сиквенс-специфічні поліаміди. Комплекси речовин з ДНК у співвідношенні 2:1, до лігандів яких також відносяться і синтетичні поліаміди, як правило, формують водневі зв’язки одночасно з 2 основами у одній парі у регіоні малої борозенки. Таке приєднання характерне лише у випадку розширення борозенки, що спостерігається саме у 2:1 комплексах. До того ж, така взаємодія полегшує існування переключення специфічності між парами (від А/Т до Г/Ц), що спостерігається у імідазол-вмісних лекситропінових речовинах, що повинні також містити піроли, що поєднані між собою амідними групами (слайд 30b та 33). Можливість взаємодії між різними ділянками поліамідів та парами основ представлена у таблиці на слайді 31.

Саме для утворення комплексів 2:1 з ДНК та пов’язаних з цим перспектив з штучної регуляції генної експресії і були синтезовані такі поліаміди, що містять імідазоли, піроли, та/або 3-гідроксипіроли у своєму складі, та здатні у якості димерів приєднуватися до широкої гами послідовностей ДНК з високою селективністю. Типові взаємодії між ДНК та такою речовиною представлені на слайді 33, де ми маємо діло з димером поліаміду будови Im-Py-Py. Також в такі сполуки недавно було введено похідні бензімідазолу у формах гідроксибензімідазолу (Hz) та імідазопіридину (Ip). Дані з селективності таких поліамінів по відношенню до пар основ ДНК представлені у нижній таблиці на слайді 31.

Розширенням даного методу визначення послідовностей ДНК є ковалентне поєднання зразу двох поліамідних молекул, які не обов’язково є ідентичними, наприклад, з утворенням поліаміду складу Im-Py-Py-linker-Py-Py-Py (слайд 34). Такий підхід дозволяє виключити можливість зміщення одного компонента димеру відносно одного вздовж послідовності ланцюгів ДНК. Такі поліаміди, які отримали назву шпилькових, можуть досягати навіть вищої селективності та спорідненості за певними сайтами, з типовими константами у наномолярному діапазоні.

Наприклад, молекула поліаміду будови Im-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-Py-β-Dp (де γ – позначка лінкеру у вигляді γ-аміномасляної кислоти, β – це β-аланін, а Dp означає диметиламінопропіламід), приєднується до послідовності d(TGTTAT) з константою дисоціації близько 1,1 нМ. Було отримано багато кристалічних структур комплексів поліамідів з ДНК, один з яких, що включає у себе димер поліаміду Im-Py-Py та послідовність ДНК d(CCAGATCTGG), з якої безпосереднім сайтом приєднання для поліаміну є центральна її частина, тобто 5’-AGATCT, представлена на слайді 35.

Результати досліджень зі специфічності поліамідів виявили, що багато з останніх здатні приєднуватися до елементів відповіді ДНК, тобто, послідовностей, за якими відбувається приєднання транскрипційних факторів або рецепторів гормонів, що призводить до конкуренції за місця зв’язування. Наприклад, репресія гену 5S-рРНК була досягнута шляхом приєднання поліаміду з з восьми кілець до сайту зв’язування d(AGTACT) всередині регіону ДНК, куди приєднується фактор транскрипції TFIIIA. Такий поліамід зв’язується з даною послідовністю приблизно у 30 разів міцніше, ніж сам фактор до свого регіону ДНК, що складається з 50 пар основ.

Було виявлено, що поліаміди також здатні приєднуватися до інших спеціалізованих ДНК-послідовностей. Так, поліамід будови β-аланін-пірол-імідазол приєднується до повторів GAA•TTC, що були виявлені у гені фратаксину з геному пацієнтів, що страждають на важку нейродегенеративну хворобу – атаксію Фрідріха. Такий поліамід був здатен після приєднання до ДНК замикати повтори у В-конформації, що попереджає формування альтернативних ДНК-структур, а, отже, і посилення транскрипції білка фратаксину, пов’язаного з патогенезом атаксії.

Окрім такого ефекту, поліаміди можуть інгібувати транскрипцію певних генів також шляхом взаємодії з репресорними сайтами ДНК. Наприклад, використання поліаміду по відношенню до наче б то інертної у транскрипційному плані послідовності d(GAGAAGAGAA) сателітної ДНК геному плодової мушки Drosophila, призводило до дуже специфічної втрати функціональності декількох певних генів, які були наближені до регіону взаємодії. Було припущено, що механізм дії поліамідів на такі сайти повинен нагадувати дію А/Т-зв’язуючих натуральних регуляторів транскрипції за місцем розташування малої борозенки.

Використання поліамідів, однак, має і свої труднощі та обмеження:

1. Зв’язуванням з поліамідами можливо поки що визначати ділянки ДНК довжиною лише 7-9 пар основ, якщ о використати більші послідовності, виникають проблеми правильного позиціонування великих молекул поліамідів відносно ДНК, що пов’язано з різною гнучкістю регіонів ДНК.

2. Існують певні проблеми також з транспортом поліамідів всередину деяких типів клітин. Багато з таких речовин проникають через плазматичну мембрану занчно повільніше, ніж, скажімо, той же Hoechst 33258 або пентамідин. Виходом з ситуації може бути дизайн фармакофорних будівельних блоків, що мімі куватимуть поліаміди, але робота з подолання даної проблеми ще не досягла свого логічного завершення.

Альтернативою поліамідам можуть виявитися асиметричні дифенілфуранові сполуки, які, як показали Ванг з колегами у 2000 році, також здатні у химерному вигляді приєднуватися до малої борозенки ДНК.